过去，进行 RNA-seq 时，会以
- RPKM（每千碱基百万读取数）或
- FPKM（每千碱基百万片段数）的形式报告结果。
然而， - TPM（每千基百万转录本）现在变得非常流行。
由于这些术语似乎有很多混淆，我想我会使用 StatQuest 来清除所有内容。
这三个指标试图标准化测序深度和基因长度。
RPKM 的计算过程参考如下操作：
- 计算样本中的总读数并将该数字除以 1,000,000——这是我们的“每百万”比例因子。
- 将读取计数除以“每百万”比例因子。这使测序深度标准化，为您提供每百万读数 (RPM)
- 将 RPM 值除以基因的长度，以千碱基为单位。这为您提供 RPKM。
FPKM 与 RPKM 非常相似。 RPKM 是为单端 RNA-seq 制作的，其中每个读取对应一个已测序的片段。 FPKM 是为PE测序的 RNA-seq 制作的。使用配对末端 RNA-seq，两个读数可以对应一个片段，或者，如果对中的一个读数没有映射，一个读数可以对应一个片段。 RPKM 和 FPKM 之间的唯一区别是 FPKM 考虑到两次读取可以映射到一个片段（因此它不会将该片段计算两次）。
TPM 与 RPKM 和 FPKM 非常相似。唯一的区别是操作顺序。以下是计算 TPM 的方法：
- 将读取计数除以每个基因的长度（以千碱基为单位）。这为您提供了每千碱基 (RPK) 的读数。
- 计算一个样本中的所有 RPK 值并将这个数字除以 1,000,000。这是您的“每百万”比例因子。
- 将 RPK 值除以“每百万”比例因子。这为您提供了 TPM。
所以你看，在计算 TPM 时，唯一的区别是你首先对基因长度进行归一化，然后对测序深度进行归一化。然而，这种差异的影响是相当深远的。
当您使用 TPM 时，每个样本中所有 TPM 的总和是相同的。这使得比较每个样本中映射到基因的读数比例变得更加容易。相比之下，使用 RPKM 和 FPKM，每个样本中归一化读数的总和可能不同，这使得直接比较样本变得更加困难。
这是一个例子。如果样本 1 中基因 A 的 TPM 为 3.33，样本 B 中的 TPM 为 3.33，那么我知道在两个样本中映射到基因 A 的总读数的比例完全相同。这是因为两个样本中的 TPM 总和总是相同的数字（因此计算比例所需的分母是相同的，无论您正在查看哪个样本。）
使用 RPKM 或 FPKM，每个样本中归一化读数的总和可能不同。因此，如果样本 1 中基因 A 的 RPKM 为 3.33，样本 2 中 RPKM 为 3.33，我不知道样本 1 中相同比例的读数是否与样本 2 中的基因 A 对应。这是因为需要分母计算两个样本的比例可能不同。