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ctDNA高通量测序临床实践专家共识（2022年版）官网
 ctDNA高通量测序临床实践专家共识（2022年版）文档

随着液态活检的快速发展，采用体液对患者的分子特征进行分析成为可能，特别是基于循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）的高通量测序（nextgeneration sequencing，NGS）技术，因其无创或微创、检测时间短、能够反映瘤内和转移灶异质性、可动态监测治疗疗效等优势而在临床得到越来越广泛的应用。与肿瘤组织样本相比，采用ctDNA进行基因检测在样本收集和处理、检测技术要求、结果解读和临床应用等方面存在诸多不同，且目前国内尚缺少ctDNA基因检测标准，因此限制了其在临床上的规范应用。为此，中国抗癌协会肿瘤标志专业委员会组织国内肿瘤临床、病理、检验、生物信息分析和高通量检测领域专家，参考国内外 ctDNA 临床应用共识、指南和最新文献，结合国内外现有的高通量测序技术要求和临床实践，从ctDNA的生物学特征、临床应用价值和范围、高通量检测的标准要求及其未来发展趋势等方面提出本共识，以促进ctDNA NGS的健康规范发展。

专家共识

ctDNA是由肿瘤细胞主动分泌或肿瘤细胞在凋亡或坏死过程中释放入循环系统的 DNA片段；其丰度受多种因素影响，波动较大，在内外因素特别是治疗压力下，其携带的生物信息可能会发生演变，且受正常细胞胚系变异或克隆性造血细胞体系突变干扰，在临床检测和报告解读过程中应特别注意。
目前已有临床证据支持ctDNA NGS检测可应用于肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等晚期实体肿瘤的伴随诊断，但涉及的驱动基因及其变异类型与相应分析体系均有严格限定，若超适应症应用时，建议与患者就检测必要性、检测费用以及局限性等内容进行充分知情。ctDNA NGS 检测已被国内外专家共识或指南建议作为多种晚期恶性肿瘤组织基因检测的替代方式，但依据其分析结果实时制定临床治疗策略时仍需高级别循证证据支持。
晚期实体肿瘤分子靶向或免疫检查点抑制剂治疗开始后，基于NGS检测的ctDNA水平定量和动态变化分析，有望成为新兴的疗效评估途径。ctDNA MRD 检测是全新的个性化技术应用领域，尚难以建立通用性技术标准，亟待通过大样本、多中心、前瞻性的临床试验验证其临床效用。ctDNA NGS 检测在临床上用于靶向或免疫治疗评估和分层时，建议就检测价值、局限性和费用等进行充分知情。
在临床环境中，ctDNA NGS检测可用于识别分子靶向治疗的耐药机制，尤其对于疑难复杂的肿瘤患者，该结果有助于后续的治疗选择决策。免疫检查点抑制剂治疗获得性耐药机制复杂，治疗选择压力下的肿瘤亚克隆演进仅为其部分原因，ctDNA靶向测序、全外显子和（或）全基因组检测仅作为其转化研究工具之一。
ctDNA NGS检测实验室质量管理需贯穿全程，ctDNA 收集、样本处理和自动化过程应按照标准化和临床验证程序进行，最大程度防范因操作差异而引发的假阴性可能。样本采集建议采用含细胞稳定剂的抗凝管，尽快完成血浆分离，提取的 cfDNA 建议在24 h内进行后续检测，否则，置于-30 ℃至-15 ℃下储存并避免反复冻融。
ctDNA NGS检测应根据项目需求选择技术路线，可依据检测基因数量及覆盖范围大小选择不同测序策略。在进行基于 ctDNA 的超高灵敏度突变检测时，建议使用分子标签技术和优化对应的生物信息分析设置，以降低由于测序平台随机误差导致的假阳性结果；建议通过建立测序噪音和克隆性造血背景库的方法降低克隆性造血及背景噪音带来的影响。
专家共识：ctDNA NGS临床检测报告应包含受检者基本信息、样本信息、实验室信息、检测项目、检测结果及变异解读、检测方法的实验室内部验证结果、检测局限性及不确定性以及进一步检测的建议等内容。实验室应建立报告 SOP，建议根据国内外文献、共识指南、临床试验证据和实践对检出的肿瘤基因突变进行分类或分级报告。

ctDNA检测优劣势

ctDNA是由肿瘤细胞主动分泌或肿瘤细胞在凋亡或坏死过程中释放入循环系统的 DNA片段；其丰度受多种因素影响，波动较大，在内外因素特别是治疗压力下，其携带的生物信息可能会发生演变，且受正常细胞胚系变异或克隆性造血细胞体系突变干扰，在临床检测和报告解读过程中应特别注意。，长度 132~145 bp，半衰期较短（一般<2 h）。

ctDNA 水平一般呈动态变化，且受多种因素影响：

肿瘤病理组织类型、部位、分期、肿瘤负荷等因素可影响ctDNA的释放。在肿瘤负荷较轻、特定部位（如颅内肿瘤）和特定组织学（如胶质瘤），以及增殖、凋亡和/或血管化水平较低的肿瘤患者中，ctDNA水平通常较低［1］。
大量其他来源的 DNA 干扰。如其他正常细胞或白细胞来源的DNA，与ctDNA一起被称为游离 DNA（cell free DNA，cfDNA）。多种生理和病理因素，如怀孕、剧烈运动、外伤、炎症、心肌梗死、自身免疫性疾病和急性中风等也会影响cfDNA的释放［2⁃3］。
克隆性造血细胞产生的cfDNA携带的基因突变信息可能会干扰ctDNA检测结果［4］。此外，其突变基因还受不同内外因素影响（包括年龄、吸烟、种族和肿瘤治疗等），如ASXL1突变在吸烟者中富集，DNA损伤应答（DNA⁃damaged response，DDR）基因（TP53、PPM1D、CHEK2）突变在接受放射、铂类药物和拓扑异构酶Ⅱ抑制剂治疗的肿瘤患者中更为常见［5］。
ctDNA 半衰期较短（一般<2 h），不同采样时间可能影响 ctDNA 含量［6］。
药物治疗影响 ctDNA 含量。有研究显示，非小细胞肺癌（non⁃small cell lung cancer，NSCLC）患者接受酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI）治疗后，ctDNA 含量在 24 h 达到顶峰，随后快速降低，提示药物也会影响ctDNA含量

与组织学检测相比，优势：

ctDNA检测具有无创或微创，可反复取材，收集、处理和分析报告周转时间（turn⁃around time，TAT）短等优势；
能克服肿瘤空间异质性，可相对全面地实时反映患者的肿瘤分子特征；
与单独组织活检相比，血浆ctDNA还可增加驱动基因突变检出率。

劣势：

外周血 ctDNA含量较低，容易造成临床检测假阴性结果；
由于胚系变异或克隆性造血突变的存在，若未用白细胞作为对照，也可能导致假阳性结果；
不同肿瘤患者或同一患者不同时段释放入血的ctDNA量也存在差异，也给 ctDNA 的临床检测和结果解读带来困难。

ctDNA NGS检测的标准

质控标准

干实验”涵盖生物信息学分析流程各步骤，该阶段质控应对

最低测序深度（血浆cfDNA标本的NGS有效测序深度应达到1000×以上，并应在80%以上的目标区域达到这个深度
平均测序深度、
覆盖均一性、
鸟嘌呤和胞嘧啶（guanine and cytosine，GC）含量、
碱基识别质量值、
比对质量值、
在靶率
等作出相应要求并遵照执行。

生信方法的要求

基于分子标签技术的数据质控和数据分析

ctDNA 检测常出现 PCR 重复序列比例高（50%~90%）、PCR 扩增和测序错误等引入的背景噪音高等问题。同时，血液中白细胞的克隆性造血突变也影响ctDNA变异的鉴定。基于分子标签技术的分析流程可帮助有效去除背景噪音，配对白细胞样本或背景库的建立可有效去除来自白细胞中克隆性造血突变引入的假阳性，提升ctDNA检测的准确性。UMI通过给每一条原始DNA片段加上一段特有的标签序列，经文库构建和PCR扩增后一同测序，根据不同的标签序列可以区分不同来源的 DNA 模板，分辨源于 PCR 扩增及测序过程中随机错误产生的假阳性突变，识别cfDNA中真正来源于肿瘤的突变，从而提高检测灵敏度和特异性，可达0.1%的检出限［71］。一般推荐1条UMI对应并至少3条reads。

测序噪音控制

建立背景库过滤噪声的大致思路是通过使用相同测序流程的样本估计基因组坐标对应区域或碱基的测序错误率，然后使用假设检验等统计方法比较目标样本对应坐标的突变频率是否显著高于估计得出的测序错误率。通过对患者肿瘤样本建立背景库过滤噪声的常用方法有 SiNVICT 和OutLyzer。SiNVICT使用肿瘤样本计算出一段基因组区域的噪音水平，通过计算信噪比的方法过滤潜在的假阳性结果［72］。OutLyzer 通过计算目标突变附近200 bp 内的每个坐标的测序错误率，并通过多次Thompson’s Tau Test 过滤离群噪声［73］。在可用较为充足的情况下，使用多个患者的正常样本建立背景库能较准确地估计噪声水平。其中代表方法有Mutect1/Mutect2（GATK）［74］，该法使用不少于 40 个没有肿瘤细胞污染的正常样本构建背景库。在此基础上发展的基于不同算法的构建背景库算法，如基于二项分布的 TNER、基于高斯分布模拟的 IDES［75］、基于泊松分布的AmpliSolve［76］等，均可有效提升突变检出准确率和召回率，去除背景噪音。

克隆性造血变异过滤

RAZAVI 等［77］发现ctDNA 存在大量未知来源的基因变异（variants ofunknown source，VUSo），大部分 VUSo 突变丰度<1%，与样本测序深度、DNA 起始量、位点的测序深度、样本染色体拷贝数无相关性，且有很好的重复性结果。在白细胞样本中也检测到大量的 VUS，且与年龄呈正相关，证实了 ctDNA 中的大部分 VUSo 来自白细胞，并非来源于测序背景噪音，这部分 VUSo 突变被定义为克隆性造血突变。因此，在不同 ctDNA 高通量测序临床应用场景，需要考虑 ctDNA 中包含有源于白细胞的克隆性造血突变。ctDNA 检测时通过配对的白细胞样本，或者汇集整合检测到的克隆性造血突变，构建克隆性造血突变背景库，可有效帮助去除克隆性造血造成的假阳性。

数据的储存与管理

随着测序深度的增加，ctDNA 下机数据有效安全的储存需要配备相应的基础设施。高通量测序会生成大量文件，下机的fastq或bam 原始文件、vcf结果文件等需长期保存，同时应保存好测序过程中完整的日志文件，以便区分高通量测序分析软件版本信息、追溯异常结果。诊断实验室应保存相关数据至少 3年，并在相关技术人员的支持下制定数据备份计划和恢复计划。

变异结果的命名规则

对基因变异的描述应遵循一定的原则和规范，推荐参考人类基因组变异协会命名指南（www.hgvs.org，登录日期2022年6月22日），转录本的选择建议采用基因座参考基因组序列数据库（Locus reference genomic；www.lrg⁃sequence.org，登录日期2022年6月22日）界定的转录本或多个国际数据库公认的主要转录本。
对遗传性肿瘤相关基因变异
的说明，建议以美国医学遗传学学院（American college of medical genetics and genomics）指南为标准，在检测结果中列出具体的变异位点信息，包括基因名称、所参考的人类基因组版本号、转录本参考序列版本号、核苷酸变异、氨基酸变异、外显子/内含子序号、等位基因杂合性、染色体编号及坐标等。

ctDNA NGS检测临床应用展望

临床研究表明基于 ctDNA NGS检测的bMSI （blood MSI）和bTMB（blood TMB）具有免疫检查点抑制剂疗效预测价值［35］。FDA于2020年8 月 26 日批准基于 ctDNA NGS 数据拟合 bMSI 和bTMB 的试剂盒用于泛实体瘤多个靶向药物及免疫检查点抑制剂的伴随诊断。但 bMSI 和 bTMB 在临床应用中受多种因素影响，如样本采集时间、检测 panel基因覆盖范围、panel 大小、测序深度、生信算法及阈值设定等，因此还需要更多的前瞻性临床研究证据支持 ctDNA NGS 数据拟合的 bMSI 和 bTMB 的临床应用前景。

HRD 状态可通过同源重组相关基因突变（homologous recombinationrepair，HRR）检测和基因瘢痕（genomic scar，GS）检测两种方式判断。两者均采用 HRR 联合 GS 检测策略评估 HRD 状态。由于基于 ctDNA NGS 对 GS 进行评估技术上具有巨大挑战，所以目前基于 ctDNA NGS 检测进行HRD 评估主要集中在 HRR 信号通路基因 SNP 检测，但国内外对 HRR 基因的定义尚缺乏统一标准；另外，随着检测技术的进步，基于 ctDNA NGS 评估 GS逐渐成为可能，但目前基于 ctDNA NGS 检测评估HRD尚有巨大的探索空间。

ctDNA中包含核酸序列、位点突变、拷贝数、甲基化、MSI、序列长度、序列丰度、出现的时空模式、在基因组上的位置特征、起始位点和终止位点特征等丰富的生物信息，如肿瘤 cfDNA 片段的长度分布、核小体位置与正常细胞显著不同，这些信息可应用于肿瘤筛查和诊断中。CancerSEEK 的癌症早筛项目通过监测 ctDNA 中 16 个基因的突变及血清 8 个蛋白质生物标志物水平，并构建 Logistic回归模型，结果该模型在 8种肿瘤共包含 1 005例患者中的敏感性为69%~98%，特异性为 99%［84］。最新的应用机器学习分类器辅助的深度甲基化测序能检测到 52%~81%临床分期为ⅠA~Ⅲ期的患者，且检测限低至万分之一，显示了更高的敏感性和特异性（特异性为 96%，95%CI：93%~98%）［85］。

总之，基于 ctDNA NGS 检测的 bTMB 具有免疫检查点抑制剂疗效预测价值，但仍有诸多因素影响bTMB 检测在临床中的应用，未来还需开展更多的前瞻性临床研究。机器学习等人工智能算法不仅能降低假阳性、提高灵敏度，还能有效整合多维度的异质信息进行全面分析，大幅提高 ctDNA 数据效力，是ctDNA数据分析的主要方向