背景

新一代测序 (NGS) 的引入是临床实验室遗传学史上最重要的技术进步之一。自 2000 年代初问世以来，NGS 已经从一种创新的研究工具转变为一种通用且有效的临床分子诊断方法。 , 与传统的 DNA 基因分型和测序方法相比，NGS 已被证明更加灵活和可扩展，并且既省时又经济。然而，NGS 有局限性。在其他挑战中，NGS 变异检出的准确性可能因方法、变异类型和大小、基因组区域以及样本类型和质量而有很大差异。对提供假阳性 (FP) NGS 结果的适当担忧导致早期依赖验证性检测来减少这种可能性，并且验证性测试仍然被许多当前的生育相关的临床实践指南所推荐，但是细节描述确很少被明确的提及。在本指南中，为临床时间提供了更具体的建议，这些建议与现有指南相一致，提供了额外的细节，因此可能有助于促进实验室之间的标准化、透明度和质量改进。

迄今为止，一些专业组织已经通过立场文件或推荐的最佳实践解决了种系检测中的交叉确认问题。在一项早期工作中，美国疾病预防控制中心召集了 Nex-StoCT 工作组，该工作组在 2012 年发布了一套用于基于 NGS 的临床测试质量保证的原则和指南。他们建议“对 NGS 检测到的所有临床可操作变异进行确认测试。”美国医学遗传学会 (ACMG) 发布的 2013 年 NGS 标准中包含类似的建议，即“所有以疾病为重点的和/或诊断测试都包括使用配套技术确认最终结果”。该指南进一步指出，实验室“必须具有丰富的 NGS 技术经验……才能决定使用正交技术进行结果确认。”该指南没有就什么构成广泛经验或需要哪些数据来验证不包括确认所有报告变异的实验室工作流程提供进一步指导。

2015 年，美国病理学家学会发布了 NGS 标准，指出每个执行 NGS 的实验室“必须制定一项政策，明确记录确认测试的适应症和/或记录他们的化验验证如何确定不需要此类测试。”美国病理学家学会在其 2022 年版分子病理学清单中指出，“实验室按照其政策中的规定对 NGS 结果进行验证性测试，并记录 NGS 验证性结果的相关性”，并指出实验室必须在验证过程中确定是否和当指示进行确认测试时。
EuroGentest 和欧洲人类遗传学学会在 2016 年提出了 NGS 指南，包括在补充材料中，“目前，建议确认所有报告的变异，以确保没有发生样本交换和/或验证信息学管道”这些出版物中的每一个都承认，他们关于 NGS 变异交叉确认的立场受到最近采用的 NGS 技术和实验室缺乏其性能的可靠经验的影响。这些出版物预计，随着 NGS 技术和生物信息学的发展，确认的必要性将会降低。
ACMG 在 2021 年更新了其 NGS 标准，建议“实验室应根据从大型和多样化数据集中提取的实验室特定质量指标识别变异的工作流程，为每个变异类别建立并提供确认测试策略以及读取比对的目视检查。在没有经过验证的方法的情况下，实验室应继续进行交叉确认。” 同样，2020 年 ACMG CFTR 测试技术标准指出，“实验室应确定……报告某些变异是否需要交叉确认，以及将使用什么标准来做出该决定。建议基于 NGS 方法的 CFTR 报告明确说明报告的变异是否已使用替代方法得到确认；如果不采用交叉确认，建议在报告的方法部分简要说明用于做出该决定的标准。

技术背景

NGS

与 Sanger 测序相比，NGS 产生的 reads 相对较短，并且这些 reads 中的每一个都可能具有相对较高的原始数据错误率。 NGS 通过生成覆盖每个目标位置的大量读数来弥补这些挑战。由于产生的数据量大且数据复杂，NGS 依赖于精心设计的生物信息学软件、数据库和算法来识别每个 DNA 标本中的遗传变异。正如其他 AMP/美国病理学家学院指南中所述，这些生物信息学系统还计算各种质量指标，这些指标可以帮助表明每个变异调用的技术可靠性。使用这些指标，很可能是 FP 的调用通常会被过滤掉。但是，过滤后的剩余调用仍可能包含 TP 和 FP 结果的混合。

NGS 错误率的临床考虑

FP 错误会对医疗保健和患者结果产生重大影响。在某些临床情况下，阳性（无论是 TP 还是 FP）基因检测报告直接影响有关预防性手术、终止妊娠、医疗干预或治疗选择的决定。 FP 还可能导致误诊和过早结束对患者疾病真正原因的搜索。
而是随着NGS检测的快速发展，应用范围越来越光放，即时错误率已大大降低，但是具有临床意义的FP的可能性也会增加。例如，考虑每测试 1,000,000 个碱基对 (1 Mb) 仅产生一个 FP 的 NGS 测试。这种低错误率与最近的一些（但不是全部）NGS 性能研究一致。在蛋白质编码区，人类大约每 2 kb 就有一个种系 DNA 变异（这一比率在非编码区更高）。因此，每 Mb 产生 1 FP 的测试将具有 99.8% 的分析（或技术）阳性预测值 (PPV) 和基于每个 bp 的分析 FP 率为 0.0001%。这种性能水平可能看起来很高，但可能还不够。例如，BRCA1 和 BRCA2 总计大约 10 kb（10,000 bp）的蛋白质编码序列，因此以这个 FP 率测试这两个基因的每 100 名患者预计会有一个分析 FP。如果将测试扩展到包括跨越 200 kb 的基因组，那么预计每五名测试患者就有一个 FP。在跨越 30 Mb 的外显子组序列中，每位患者的结果中预计有 30 个 FP。

要了解 FP 的影响，应该考虑临床 PPV，而不仅仅是分析 PPV。临床 PPV 考虑了变异解释和接受测试的患者群体。继续上面使用的 BRCA1/2 示例，假设每 100 名患者发生一个分析性 FP 错误，并且这些 FP 中有一半可能看起来是致病性的，导致每 200 名测试的患者有一个潜在的重要 FP。一般而言，当将 BRCA1/2 检测应用于具有强烈提示遗传性乳腺癌或卵巢癌个人史或家族史的患者时，大多数（并非所有）种族群体中约有 10% 的患者被发现为真正阳性。 , 因此，此示例测试的临床 PPV 在这些患者中大约为 95%——21 个阳性结果中有 1 个是假的。然而，在筛查环境中，如果 0.5% 的患者真正呈阳性，则临床 PPV 将仅为 50%。换句话说，这个示例筛选测试的阳性结果可能是假的，也可能是真的。在筛选环境中使用的基因组将具有更低的临床 PPV（TP/(TP+FP))。

总之，即使分析性 FP 的比率很低，NGS 测试的基因和患者数量越来越多，也可能导致大量 FP 临床报告。

NGS 错误的技术考虑

所有实验室方法都可能出错。已建立的技术，如 Sanger 测序，通常被称为金标准，只有在认识到这些方法的局限性时才适用。由于 NGS 更新且发展迅速，其局限性可能不太为人所知，尽管这种情况也在发生变化。对于某些类别的变异，某些 NGS 方法现在可能与 Sanger 测序一样准确， , , 这提出了一个有效的问题：使用 Sanger 测序确认 NGS 结果会降低整体准确性吗？如本文所述，如果使用得当，答案是否定的，因为 Sanger 和 NGS 是正交技术，这意味着它们产生的错误在大多数情况下是不相关的（参见建议 4）。然而，由于这两种方法都不是完美的，因此当两种方法不一致时盲目地假设一种方法（在本例中为 Sanger）是正确的可能会增加错误率，正如已经证明的那样。相反，如果差异得到适当调查和解决，那么组合过程（NGS + Sanger 确认）的特异性将优于单独使用任何一种方法。
实验室或许能够建立严格的标准，将高置信度的 TP 变异调用与那些不太自信且可能是也可能不是 TP 的变异调用区分开来。重要的是要认识到这些严格的标准与质量过滤器是分开的，质量过滤器用于删除很可能是 FP 的变异调用。各种研究表明，简单的技术标准（例如 NGS 读取深度）并不能单独充分区分高置信度 TP 和候选 TP 类别。理想情况下，单个稳健的变异调用质量分数可以做到这一点，尽管最常用的变异调用者产生的分数（截至本出版物发布时）同样被证明是不够的。相反，标准的组合似乎更有效。

对于包括 NGS 在内的任何实验室技术，FP 错误都可以分为两种类型：系统错误或随机错误。随机错误可以在任何时间或任何地点发生，而系统错误优先发生在特定情况下（例如，在重复序列中）。在现代 NGS 中，系统错误占所有 NGS FP 的很大一部分，这既带来了机遇，也带来了复杂性。机会：由于系统误差背后的因素可以通过适当的研究进行量化，因此可以识别最有可能成为系统性 FP 的患者的变异调用，并确保这些变异得到确认。复杂的是，根据定义，系统错误会反复出现，这意味着使用相同的技术在多个样本中观察相同或相似的变异几乎无法确信变异调用实际上是真实的。要知道这样的变异调用是否是 TP，需要一种正交方法。

本指南的局限性

建议旨在应用于使用 NGS 检测种系（宪法）DNA 变异的临床测试。我们简要描述了可能适用于通过种系检测检测到的某些其他变异类型的特殊注意事项（例如，种系镶嵌和线粒体变异，需要单倍型分析才能正确解释的变异）。其他临床 DNA 测试不在范围内（包括肿瘤测序和液体活检测试，两者都旨在检测体细胞突变，以及无创产前筛查，旨在检测母体血液中的胎儿变异）。
建议旨在适用于撰写本文时临床实验室常用的短读长 NGS 平台和化学品 [例如，Illumina 和 Ion Torrent ]。我们没有详细考虑临床实验室中不太常见的 NGS 平台、不再销售的平台或任何较新的单分子长读长平台。

建议

Index	Recommendation
1	Clinical laboratories offering germline testing using NGS should establish a written policy regarding orthogonal confirmation of NGS results./使用 NGS 提供种系检测的临床实验室应制定有关 NGS 结果交叉确认的书面政策。
2	Laboratories’ orthogonal confirmation policy should be overseen and approved by a qualified and appropriately certified medical professional with training and experience in NGS./实验室的交叉确认政策应由具有 NGS 培训和经验的合格且经过适当认证的医疗专业人员监督和批准。
3	Laboratories’ confirmatory methods, platforms, and associated bioinformatics should be validated and maintained under appropriate regulatory oversight, as for other aspects of the test./实验室的确认方法、平台和相关的生物信息学应在适当的监管监督下得到验证和维护，就像测试的其他方面一样。
4	Laboratories’ confirmatory methods should be orthogonal. Discrepant results between NGS and a confirmatory assay should be investigated and resolved, rather than accepting any one method to be always correct./实验室的确认方法应该是正交的。应调查和解决 NGS 与验证性测定之间的差异结果，而不是接受任何一种方法始终是正确的。
5	Laboratories should perform confirmatory testing for reported germline variants with significant clinical implications, except for variant calls meeting technical criteria rigorously demonstrated to ensure high positive predictive value from NGS alone./实验室应对已报告的具有重大临床意义的种系变异进行验证性测试，但符合严格证明的技术标准的变异检出除外，以确保单独从 NGS 获得高阳性预测值。
6	Laboratories should clearly articulate their specific policies, criteria, and methods regarding orthogonal confirmation in written materials readily available on request./实验室应在可应要求提供的书面材料中清楚地阐明其关于交叉确认的具体政策、标准和方法。
7	Laboratories’ clinical test reports should summarize orthogonal confirmation policy in every report, and when exceptions to the policy are made, these should be clearly indicated./实验室的临床试验报告应在每份报告中总结交叉确认政策，当政策有例外时，应明确指出。
8	Special considerations apply to certain NGS-based test types and findings./特殊注意事项适用于某些基于 NGS 的测试类型和结果。

因全文较长，在此仅针对生信和方法学相关部分进行展开，其他部分（更多的是关于整体执行流程的规范和要求等，请参考原文）

Recommendation 1: Clinical Laboratories Offering Germline Testing Using NGS Should Establish a Written Policy Regarding Orthogonal Confirmation of NGS Results

实验室应该形成规范，明确什么情况下需要对结果进行确认。制定策略时，考虑的变量包括测试内容（例如，单基因与外显子组测序）、NGS 平台、变异类型、变异分类、质量指标、临床影响和其他因素。

Recommendation 2: Laboratories’ Orthogonal Confirmation Policy Should be Overseen and Approved by a Qualified and Appropriately Certified Medical Professional with Training and Experience in Next-Generation Sequencing

制定验证策略的人，应该是结合遗传学相关背景，由经验丰富的专业人员制定和实施。

Recommendation 3: Laboratories’ Confirmatory Methods, Platforms, and Associated Bioinformatics Should be Validated and Maintained Under Appropriate Regulatory Oversight as for Other Aspects of the Test

由于实际限制，特别是需要确认新的变异，分析验证可以接受特定于平台或方法的。例如，可以接受基于方法的基于 Sanger 扩增子测序的验证，而不是验证单个引物对——这是一项不切实际且繁重的任务。这种基于方法的方法应包括对整个确认工作流程的端到端验证，包括 PCR 引物设计、湿实验室 PCR 扩增测定以及用于读取 Sanger 测序数据的手册或软件程序。如果使用多种 PCR 扩增方案（例如，富含 GC 的 PCR 和长程 PCR），则必须分别验证每种 PCR 方法。由于此方法未验证单个引物对，因此在 NGS 结果与确认结果不同的情况下，对任何差异进行额外调查至关重要。

Recommendation 4: Laboratories’ Confirmatory Methods Should be Orthogonal: Discrepant Results between NGS and a Confirmatory Assay Should be Investigated and Resolved, Rather Than Accepting any One Method to be Always Correct

确认测试的目的是发现 FP 并防止它们被报告。重要的是要记住，许多 NGS FP 错误是系统性的 , （即，可能会重复）并且没有任何检测是 100% 准确的（请参阅技术背景）。因此，应选择验证性检测，以使验证性检测的错误概况与主要 NGS 检测的错误概况尽可能少相关。以不同方式操作且具有最小重叠误差分布的两种测定的概念通常称为正交性。
选择验证性检测需要实验室主任仔细判断。尽管可能无法实现完全正交，但可以避免明显的问题。例如，简单地重复主要的 NGS 测定不会提供任何程度的正交性，并且可能会导致报告系统性 FP。我们建议确认分析既不使用相同的核心测序技术，也不使用相同的文库制备方法。强烈反对使用不同的生物信息学管道重新分析相同的原始数据作为确认方法。
扩增子的 Sanger 测序在当前实践中经常用于对由 NGS 识别的序列变异进行交叉确认，NGS 通常使用基于杂交的靶向。同样，微阵列、定量 PCR 或多重连接依赖性探针扩增通常用于确认 NGS 检测到的 CNV。鉴于方法上的差异，人们期望这些策略具有很大程度的正交性。
因为没有一种检测是 100% 准确的，所以当主要检测和验证检测之间的结果发生冲突时，不应假定这两种检测都是正确的。相反，在从报告中包含或排除变异之前，应尽可能合理地调查和解决差异的原因（图 3）。调查应包括检查主要和确认化验的基础数据，还可能包括重复测试或第三种（已验证的）测试方法。实验室应将验证性检测的敏感性限制视为导致差异的潜在原因，并根据需要对特定患者或变异体采用另一种方法。例如，在感兴趣区域缺乏足够探针覆盖的拷贝数微阵列可能会产生 NGS 检测到的 TP CNV 的假阴性确认结果。同样，由于等位基因丢失，Sanger 测序可能会提供假阴性确认结果。在初始 NGS 测试或确认过程（即样本交换）中测试不正确的样本是造成差异的另一个潜在原因，应在调查期间予以排除。当无法在主要和确认检测之间实现明确的解决方案时，报告或省略相关变异的决定应由经验丰富的临床分子专业人员做出。如果报告了具有不一致的交叉方法结果的变异，则应在报告中描述验证性分析的结果以及对变异是 TP 的可能性的解释。

Recommendation 5: Laboratories Should Perform Confirmatory Testing for Reported Germline Variants with Significant Clinical Implications, Except for Variant Calls Meeting Technical Criteria Rigorously Demonstrated to Ensure High Positive Predictive Value from NGS Alone

实验室关于哪些变异需要交叉确认的最终决定将取决于两种类型的标准，这两种标准都应在实验室的确认政策中明确描述，并分别应用于可能包含在测试报告中的每个变异调用。

技术标准：根据可用数据，此变异调用成为分析 TP 与 FP 的可能性有多大？
医学标准：这种变异对患者护理产生重大临床影响的可能性有多大？

技术标准

可以制定严格的标准来识别极不可能是 FP 的变异调用（图 1）。尽管读取深度、变异类型、变异等位基因分数、基因组背景和许多当前的质量评分计算已被证明不足以单独用于此目的，但这些标准的组合已被证明是有效的（见前述技术考虑）。这些组合可能包括以下元素。

质量指标：变异检出工具通常会为每个变异检出产生许多质量指标。例如，常用的 GATK 变异调用程序会生成指南推荐的多个分数，并且每个分数都有助于识别最高置信度的变异调用。汇总分数可能无法像单独考虑多个基础质量指标那样有效。
变异类型： SNV 在人类 DNA 中比插入缺失更为普遍。然而，Indel 变异调用往往比 SNV 调用具有更高的错误率，并且更有可能被解释为许多基因的致病性，而功能丧失是一种致病机制。对于某些变异类型（例如，SNV），通常更容易积累具有正交数据的大型数据集，以确定哪些调用可能需要或不需要确认。对于其他变异类型（插入缺失和 CNV），实验室可能没有足够大的数据集来以统计合理的方式确定标准。由于这些原因，变异类型可能是确定哪些变异需要确认的一个重要标准。 SNV 和插入缺失的最佳质量阈值可能不同。
复杂区域：基因组背景可能是识别容易出现 FP 且可能未被通用质量指标充分标记的区域的重要标准。这些区域通常包括低复杂性重复序列，例如均聚物和短串联重复序列、移动元件以及具有高度相似的旁系同源基因或假基因的基因。在验证过程中，实验室可能会识别基因组中由 NGS 识别的变异不可靠的区域，并且应始终进行交叉确认。
变异频率：变异频率是具有复杂含义的重要质量指标。等位基因分数的变异调用（种系 DNA 中远离 50:50 变异等位基因分数的杂合子）通常是 FP，尽管它们可能是受技术人工制品（例如，参考偏差或错误映射）影响的 TP。

如果没有额外的充足验证，不建议使用以下方法

在不同样本中重复确认相同突变。一些指南建议，在验证研究或常规实践中，实验室可能会在特定变异被确认为 TP 一定次数后停止确认。不幸的是，系统错误在 NGS 中很普遍，不同样本中相同变异的调用可能具有截然不同的质量水平。研究表明，对于相同变异的后续观察结果的准确性，重复确认的预测能力有限。
人工审查 NGS 数据作为确认的替代方法。人工审查 NGS 数据可以识别变异检出软件出现 FP 错误的某些情况。实验室政策可能允许在不使用二次检测的情况下去除此类变异。然而，反之亦然：在人工审查中没有发现问题并不一定意味着变异是没问题的。可能导致 FP 的生化和绘图问题在人工审查中并不总是很明显。

不同实验室使用的 NGS 过程可能存在许多实质性的和细微的差异，并且不同测试检查的目标之间通常存在重要差异。每个实验室都应使用自己的数据集，并使用这些数据制定自己的标准，而不是试图使用其他实验室的数据或标准。
优化算法（可能是启发式的、统计的或基于机器学习的）已被证明可用于确定哪些质量指标和阈值的组合最能提供信息。这些方法可能需要大量的输入数据集。具有良好特征的样本，例如瓶中基因组联盟目前发布的七个样本（https://www.nist.gov/programs-projects/genome-bottle。但是这些数据也会存在一个问题，1.没有覆盖全部的基因组区域。2.该项目数据主要是蛋白编码区的SNV变异。不建议将确定的标准应用于不同类型的数据集合。
一旦建立了技术标准应该进行详细的验证，验证方案可以参考AMP提供的详细建议（https://www.amp.org/resources/validation-resources）

医学标准

当技术评估表明可报告变异存在成为分析性 FP 的风险时，如果此类 FP 可能对当前或未来医疗状况的诊断、治疗或管理质量产生不利影响，则建议进行交叉确认病人。对于与患者检测指征相关的高或中度外显率基因的致病性和可能致病性发现，通常就是这种情况。相比之下，良性变异通常没有临床影响，通常不会被报道。因此通常不需要确认良性变异。

不确定的变异解释：尽管意义不明的变异 (VUS) 通常不会影响临床决策，但一些 VUS 可能在以后被重新分类为致病性或可能致病性。因此，如果变异由于其初始 VUS 分类而未得到确认，则分析 FP 可能会出现问题。如果实验室政策是部分或所有 VUS 因其分类而未得到确认，则应向临床医生明确说明该政策及其含义。如果 VUS 后来被重新分类为致病性或可能致病性，则实验室应将其当前的标准政策应用于变异，以确定在发布修订报告之前是否需要进行确认测试。
主要发现与次要发现：虽然主要发现（即与患者的检测指征直接相关的那些）通常具有最大的临床影响，但次要（有时称为偶然）发现也可能具有重大影响。例如，考虑在接受心血管疾病诊断的患者的外显子组序列中继发发现致病性 BRCA1。 ACMG , 推荐的基因变异或药物遗传学相关基因变异是常见的二次发现类型，可能会在临床种系检测中报告，并且值得交叉确认。
携带者发现：在隐性基因中发现的单等位基因致病变异可能对生殖医学产生重大临床影响。此外，在一些发现这种携带者的患者中，稍后可能会使用不同的测试方法发现同一基因中的第二个致病变异，从而使最初的发现与他们的医疗保健直接相关
外显率：尽管低外显率变异可能带来相对较低的疾病风险，但高外显率和低外显率的致病变异都可以表明在当前的医疗实践指南下临床护理发生了重大变化。

在决定哪些变异需要基于医学理由进行确认时，实验室应仔细权衡风险。实验室政策应该让临床医生清楚了解，以便他们可以自信地知道哪些变异在任何临床报告中需要确认，哪些不需要

Recommendation 6: Laboratories Should Clearly Articulate Their Specific Policies, Criteria, and Methods Regarding Orthogonal Confirmation in Written Materials Readily Available on Request

实验室应提供有关交叉确认政策的书面材料和总结确认政策验证结果的书面文件，包括实验室是否已将某些变异排除在技术确认之外。
书面文件应该是最新的，包括更新和修正，并包括实验室的标准标准，报告的变异是否接受或不接受确认测试。请注意，一般性陈述（例如，符合高质量标准的变异）并不能单独满足此建议。书面文件还应包括针对初始 NGS 数据和确认测试数据不一致的变异检出所采取的措施。此外，文件应包括为标准政策的例外情况采取的行动，包括由于技术原因无法进行确认的情况，例如样本可用性不足或确认化验未能产生可靠数据。

Recommendation 7: Laboratories’ Clinical Test Reports Should Summarize Orthogonal Confirmation Policy in Every Report, and when Exceptions to the Policy Are Made, These Should be Clearly Indicated

实验室应在报告中包含其标准交叉确认政策的摘要。这可以是一个简明的总结，也可以是对实验室标准的参考，以确定哪些报告的变异需要进行确认测试。如果实验室没有确认政策或不定期进行交叉确认，则应说明这一点。
可能存在由于技术原因无法进行确认的情况，例如样本可用性不足或确认化验未能产生可靠数据。临床报告中应明确记录实验室标准变异确认标准的所有例外情况。

示例报告语言：
此变异未通过既定的 NGS 置信度阈值，因此需要根据实验室的标准确认政策通过正交方法进行确认。反复的 Sanger 测序确认尝试未能产生可解释的数据。我们建议在具有经过验证的基因特异性方法的临床实验室中确认此变异。

Recommendation 8: Special Considerations Apply to Certain NGS-Based Test Types and Findings

Sample Identity Confirmation 样本身份确认

正交检测可用于双重目的，即确认变体是分析性 TP 并确保它存在于正确患者的 DNA 样本中。因此，确认化验可以检测 NGS 期间的样本或数据混淆，特别是当确认化验是对患者初始标本的单独等分试样进行时。如果实验室不对某些或所有具有临床意义的变异进行确认，则强烈建议使用替代的阳性样本追踪方法。示例包括单核苷酸多态性检测，可以与 NGS 结果进行比较以确认样本身份，或使用掺入寡核苷酸。这些机制还有一个额外的优势，即可以跟踪具有阴性或阳性发现的样本。

Location Resolution 位置分辨率

短读长 NGS 平台不能总是准确地确定在具有同源假基因或基因家族成员的基因中观察到的变异的具体位置。例如，映射到 PMS2 基因的变体实际上可能源自 PMS2CL 假基因，该假基因在该基因的特定区域与 PMS2 的序列有 99% 相同。使用例如长程 PCR 或长读长测序的确认分析既可以确定潜在致病变异位于哪个位点，也可以确定它是否实际上是一个分析的TP。

Mosaic Variants

在 NGS 结果中以低变异等位基因分数观察到的变异提出了具体的考虑。由于多种原因，无论是生物学原因还是技术原因，变体都可能出现在低等位基因部分，包括以下原因:

嵌合体
不确定的克隆性造血，可在血液、口腔和唾液标本的淋巴细胞衍生 DNA 中观察到。
来自同源区域（例如，假基因）的读数错配。
参考偏差：NGS 读数包含与参考基因组中存在的不同等位基因的事实可能不容易映射到正确的基因组位置。
系统错误
如果实验室在临床上报告了低等位基因分数的变异，那么尝试解决等位基因不平衡原因的适当程序就很重要。报告语言也很重要，特别是当对低等位基因分数的根本原因存在歧义时。确认技术，尤其是 Sanger 测序，可能降低了对实际镶嵌变异的敏感性，因此可以看到相对常见的情况，即通过 NGS 观察到的 TP 在确认分析中是假阴性。

Mitochondrial Variants 线粒体变异

由于异质性，线粒体基因组中的变异可能存在于低等位基因部分。除了上述与镶嵌变异相关的挑战外，线粒体变异可以是多等位基因，在 DNA 混合物中存在超过两个等位基因，这种情况类似于肿瘤测序中因异质性而遇到的情况。实验室确认政策应详细说明如何处理和报告此类情况。

Haplotyping/Phasing 单体型/定相

某些变异的临床解释可能需要单倍型分析（即确定同一基因或区域中多个变异的顺式或反式关系）。该步骤在隐性基因（确定何时观察到双等位基因、复合杂合变异）和需要多个顺式变异来识别特定等位基因（例如，HLA 或细胞色素基因中的星号等位基因）的基因中可能很重要。短读长 NGS 平台通常无法确定大于几百个碱基对的基因组区域的相位。可以通过以下确定更大距离的单倍型和相位。

Mendelian analysis (when family members are available for testing).
Imputation or other statistical inference methods.
Certain confirmatory assays, such as long-range PCR or long-read sequencing.

Familial Sample Testing 家族样本检测

通常在基因检测中，家族样本与先证者的样本一起进行检测，以帮助进行变异分类（即确定共分离和/或阶段）。如果家庭成员使用 NGS 进行测试并收到个性化报告，则应按照与先证者相同的标准对向这些人报告的变异进行交叉确认。因为许多 NGS FPs 是系统的，而不是随机的，所以强烈建议不要简单地在多个个体中观察相同的变异，无论是否相关，作为一种确认技术。

Tumor Testing

仅肿瘤测序可以检测种系变异，尽管目前的肿瘤测试对是否以及如何报告此类变异存在差异。关于这个主题的指南不断发展。 , 在某些情况下，患者被转介到不同的实验室进行 NGS 种系后续检测，在这种情况下，种系实验室可能会将先前的肿瘤检测视为对未发现的任何种系变异的确认。这是否合适取决于种系实验室主任对这两个测试是否正交的判断（见建议 4）。例如，如果两个测试使用相同的测序平台和捕获方法，则可能会重复出现系统错误。肿瘤测试和种系测试使用不同标本这一事实并不能单独使测试正交。