By 赵东晓

NGS检测过程中经常遇到需要第三方验证的需求，不管是为了证明检测结果准确性，还是前期方法学检测的需求，都不可避免的需要面对各种第三方验证。
而Fish检验就是一个常用的用来检验融合的方法。最近同事对Fish进行了一些调研，简单梳理以备后用。

Fish调研

NGS报告融合推药逻辑

1类融合多见，为常见伴侣融合，是指南里面提到的，且有功能证据证明激活的融合亚型；
针对1类融合，相同基因，不同断点和亚型，现在药物推荐还没有区分差别。
2类融合少见，是指那些没有指南支持，仅有少量文献证据的罕见融合；
3类融合不推药；

通过FISH（荧光原位杂交）检测融合，目前有2种方法：

第1种（应用较广）：可以设计已知融合基因的探针，比如针对ALK的，用红色和黄色覆盖ALK基因的上下游区域，正常就是红黄在一起，融合就是ALK发生了断裂就是红黄分开了。此方法检出的融合，不能确定是何种融合亚型，推药只能按照广义层面上的融合大类来推荐用药。
第2种（不经济实用）：可以设计已知融合基因和伴侣基因的探针，比如针对ALK和EML4的，ALK全部用红色探针覆盖，EML4用黄色探针覆盖，正常就是红黄分开，融合就是红黄在一起。此方法检出的融合，为常见伴侣基因的融合，为1类融合，推药逻辑没有差异。

以ALK探针为例：Vysis ALK break-apart probe (Abbott Molecular)

美国食品药品监督管理局(FDA)已批准的FISH分离探针试剂盒(Vysis ALK Break Apart FISH Probe Kit; Abbott Molecular, Inc.)可用于检测ALK融合基因的表达。该试剂盒设计的两种探针分别标记ALK基因第20号外显子断裂点的两端，在5 ‘(着丝粒)侧有一个约442 kb的绿色探针，在3 ‘(端粒)侧有一个约300 kb的橙色探针，橙色区域包括了ALK激酶活性区。

ALK基因：chr2:29,415,640-30,144,452 (GRCh37/hg19 by Entrez Gene)，Size:728,813 bases.

结果判读

阴性信号：

一个癌细胞核内至少有一个橙色和一个绿色信号，橙色信号与绿色信号相互邻近或叠加，其问距小于两个信号直径。
一个癌细胞核内至少有一个橙色和一个绿色信号，有单独的绿色信号，但无相应的橙色信号。

阳性信号：

一个癌细胞核内至少有一个橙色和一个绿色信号，橙色和绿色信号的间距大于两个信号直径。
一个癌细胞核内至少有一个橙色和一个绿色信号，有单独的橙色信号，但无相应的绿色信

阳性判定：

计数50个肿痛细胞，若阳性肿指细胞数多于25个，该样本为阳性；
若阳性肿指细胞数小于5个，该样本为阴性；
阳性肿指细胞数介于5-25个，为可疑阳性。
需要另计数50个肿指细胞，将前后两次的合计100个肿瘤细胞的信号状况汇总。
- 若阳性肿痛细胞比例少于1598(15/100),该样本为阴性。
- 着阳性肿痛细胞比例多于159(15/100,该样本为阳性。

该方法只能判断ALK基因是否断裂，可以检测所有的融合型，但不能区分与其发生融合的基因是什么。
阳性细胞为存在橙绿信号分离或单独橙色信号的细胞。

ALK基因的检测方法

ALK基因的检测方法有荧光原位杂交（FISH）、显色原位杂交（CISH）、免疫组化（IHC）、基于PCR的各种方法、NGS二代测序等。

检测ALK融合的各种技术的特点总结

参考：中国间变性淋巴瘤激酶(ALK)阳性非小细胞肺癌诊断专家共识(2013版)

参考：Int J Mol Sci. 2019 Aug 13;20(16):3939. doi: 10.3390/ijms20163939.

总结

ALK基因融合的检测要尽可能采用两种以上的方法相互印证，以免出现漏检或假阴性结果，使得部分病友失去从靶向药中获益的机会。检测实验室应该根据组织标本类型选择合适的检测技术。当怀疑一种技术的可靠性时（如FISH的肿瘤细胞融合率接近15％时），可以考虑采用另一种技术加以验证。