miRNA-07.外泌体蛋白组分析平台

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外泌体蛋白组（LC-MS/MS）分析平台的模块划分、标准流程、EV 标志物与污染蛋白 QC、无标记定量、差异分析与多组学衔接；各模块问题、主流方法与难点。

外泌体蛋白组分析平台，处理的是 液相色谱-质谱（liquid chromatography–mass spectrometry，LC-MS/MS）实验产生的鉴定与定量数据。与外泌体转录组平台（miRNA-06）互补：前者读 RNA 组成，后者读 蛋白 组成——共同回答外泌体样品内容物是否可信、是否符合 EV 特征。

零基础读者建议先读 miRNA-08-蛋白质组学实验与数据分析入门，再回看本文平台模块。

平台架构见 miRNA-05-外泌体多组学生物信息分析平台概览；模块开发估时见 miRNA-04 §3；分阶段落地计划（转录组验收后启动）见 miRNA-14 §5。

段末注释：LFQ（label-free quantification，无标记定量）通过质谱峰强度比较蛋白丰度；DIA（data-independent acquisition，数据非依赖采集）与 DDA（data-dependent acquisition，数据依赖采集）在搜库与定量引擎上路径不同，平台需在接入层抽象统一。

图 1　外泌体蛋白组分析平台框架

图 1 主链路：搜库接入 → 鉴定 QC → EV 标志蛋白 → 定量矩阵 → 污染过滤 → 归一化/批次 → QC 报告；与 NTA/Western 元数据联动；放行后进入差异蛋白、富集与 miRNA 多组学关联。

1. 平台定位与边界

项目 说明
主场景 外泌体/EV 馏分蛋白鉴定、EV 标志物 QC、定量与差异分析
主输入 搜库结果（MaxQuant、FragPipe 等）；可选原始 mzML
主输出 鉴定 QC 报告、蛋白矩阵、标志物面板评分、（可选）差异蛋白列表
指南对齐 MISEV2023、EV-TRACK 检查项
与转录组关系 同一样品 ID 下与 miRNA QC 三角验证（miRNA-05 §5）

2. 外泌体方向：核心问题与评估维度

蛋白组读的是外泌体蛋白 cargo，须与粒径、Western 及转录组 miRNA 谱交叉验证。平台需回答：

  • 实验是否成功：鉴定数与搜库质量是否达标？
  • 是否像 EV：标志蛋白是否支持囊泡身份？
  • 是否「干净」：血浆 / 胞内 / 实验污染蛋白是否可控？

图 2　外泌体蛋白组核心评估问题

图 2 概括七个评估维度；与 MISEV2023、EV-TRACK 检查项对齐。

维度 核心问题 典型指标 / 动作 对应模块
① 鉴定质控 质谱/搜库是否成功？ 蛋白/肽段鉴定数；FDR ≤ 1%；分数分布 P2
② EV 身份 是否具备典型外泌体蛋白特征？ CD63/CD9/CD81/TSG101/Alix 检出与共现评分 P3
③ 蛋白污染 有无非 EV 或实验污染？ 白蛋白、载脂蛋白；核蛋白；CRAP 角蛋白 P5
④ 定量可靠性 丰度矩阵能否用于比较？ LFQ/DIA 缺失率；动态范围；离群运行 P4、P6
⑤ 基质干扰 血浆 / 培养背景是否过高？ 血浆高丰度蛋白占比；FBS 蛋白签名 P5
⑥ 物理验证 组学是否与物理 QC 一致？ NTA 峰径/浓度；Western 条带（元数据） P12
⑦ 多组学一致 蛋白 QC 与 miRNA 是否同向？ 联合判读：合格 / 边缘 / 不一致（见 miRNA-05 §5） P11、P10

典型联合场景：标志蛋白阳性但 miRNA 谱弱 → 疑空囊泡或 RNA 降解；两者污染信号同向升高 → 制备不合格。

3. 平台模块地图

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[P1 数据接入] → [P2 鉴定 QC] → [P3 EV 标志物] → [P4 定量矩阵]
                        ↓              ↓
                   [P5 污染过滤] → [P6 归一化/批次]
                        ↓
              [P10 QC 报告] ← [P12 物理指标联动]
                        ↓
         （放行后）[P7 差异蛋白] → [P8 富集] → [P9 网络（可选）]
                        ↓
                   [P11 miRNA 关联]
模块 名称 优先级
P1 质谱数据 / 搜库结果接入 P0
P2 蛋白鉴定 QC P0
P3 外泌体标志蛋白面板 P0
P4 无标记定量与蛋白矩阵 P0
P5 污染 / 高丰度蛋白过滤 P0
P6 缺失值、归一化与批次校正 P0
P7 差异蛋白分析 P1
P8 功能富集与通路 P1
P9 蛋白互作网络 P2
P10 自动化 QC 报告 P0
P11 与转录组 / miRNA 关联 P1
P12 与 NTA/Western 元数据联动 P1

4. 标准分析流水线

3.1 流程总览

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质谱 raw 数据（实验端）
  → 搜库（MaxQuant / FragPipe + DIA-NN 等）
  → 蛋白鉴定 FDR 过滤
  → EV 标志物面板 + 污染蛋白评估
  → LFQ / DIA 定量矩阵
  → 缺失值处理 + 归一化 + 批次（可选）
  → QC 报告 /（放行）差异与富集

平台分析引擎通常不替代搜库（计算密集、参数敏感），而是标准化 ingest 搜库输出，保证 QC 与统计口径一致。

3.2 QC 报告建议字段

  1. 每样蛋白/肽段鉴定数、覆盖度分布
  2. CD63/CD9/CD81/TSG101 等检出与强度（相对）
  3. 污染/高丰度蛋白占比（CRAP、血浆列表）
  4. 重复样品相关性 / PCA
  5. 与 NTA/Western 一致性摘要（P12）
  6. 结论：合格 / 边缘 / 不合格

5. 核心模块详解

P1　数据接入

项目 内容
要解决的问题 多引擎、多批次搜库结果格式不一；run–sample 映射错误
主流方法 MaxQuant proteinGroups.txt；FragPipe + IonQuant；mzTab
技术难点 DDA vs DIA 定量不可直接混比；搜库参数文档化
平台策略 抽象为统一「蛋白 × 样品 × 强度」层 + 引擎元数据

P2　鉴定 QC

项目 内容
要解决的问题 实验失败、搜库质量差、伪蛋白污染下游
主流方法 FDR ≤ 1%；蛋白/肽段数阈值；分数分布图
技术难点 外泌体总蛋白低 → 鉴定数天然少于全细胞；血浆动态范围极大
判读 与历史合格批比较，而非绝对阈值一刀切

P3　EV 标志蛋白面板

项目 内容
要解决的问题 蛋白层面确认 EV 身份，排除非囊泡污染
主流方法 CD63、CD9、CD81、TSG101、Alix、HSP70 等（MISEV 推荐集）
技术难点 无单一金标准；MV/lipoprotein 共分离；未鉴定 ≠ 不存在（需 Western）
平台输出 四跨膜蛋白共现评分 + 与阴性对照差值

与 miRNA-03 §6 对应：蛋白阳性但 miRNA 差 → 可能空囊泡或 RNA 降解。

P4　无标记定量

项目 内容
要解决的问题 生成可比蛋白丰度矩阵
主流方法 MaxQuant LFQ；DIA-NN / OpenSWATH（DIA）
技术难点 低输入 LFQ 缺失率高；DIA 依赖谱库质量
注意 iBAQ 仅作组成参考，不作唯一差异依据

P5　污染蛋白过滤

项目 内容
要解决的问题 血浆白蛋白、载脂蛋白、核蛋白、角蛋白干扰 EV 解读
主流方法 CRAP；Plasma Proteome Database 高丰度；EV-TRACK 非 EV 列表
技术难点 过度过滤删掉真实 cargo；FBS 培养背景
平台策略 过滤前后双报告；差异分析默认用过滤后矩阵并记录规则

P6　缺失值与批次

项目 内容
要解决的问题 MNAR（missing not at random）缺失；运行间系统偏差
主流方法 检出率过滤；MinProb/QRILC 插补（谨慎）；median/VSN 归一化；ComBat
技术难点 外泌体 MNAR 为主，插补易假阳性；小样本 ComBat 不稳
推荐 差异分析优先 MSstats / MSqRob2 等质谱稳健方法

P10　QC 报告

项目 内容
要解决的问题 统一、可审计的蛋白组 QC 交付
主流方法 HTML/PDF 模板，对齐 MISEV2023 条目
与转录组 报告样式与 miRNA-06 T10 统一；联合判读见 miRNA-05

P12　物理指标联动

项目 内容
要解决的问题 NTA 粒径/浓度、Western 与组学 QC 三角验证
主流方法 元数据表字段 + 报告「组学–物理」段落
技术难点 NTA 不能证明外泌体；手工录入错误
逻辑 单一物理指标合格不能替代蛋白/ miRNA QC

6. 标准版分析能力（Phase 2）

P7　差异蛋白

项目 内容
要解决的问题 组间显著变化蛋白
主流方法 limma；MSstats；FDR；火山图/热图
前提 QC 放行；与 P5 过滤策略一致
技术难点 重复少 → 方差不稳；离群 LC-MS 运行

P8　功能富集

项目 内容
要解决的问题 差异蛋白的 GO/KEGG/Reactome 主题
主流方法 clusterProfiler；GSEA
外泌体关注 膜运输、ESCRT、囊泡融合相关通路
技术难点 鉴定数少 → 富集 power 不足

P9　蛋白互作网络（可选）

STRING / BioGRID 构建网络；EV 覆盖度有限，宜二期交付。

7. 多组学衔接（P11）

整合点 方法
样品配对 与转录组共用样品 ID（miRNA-05 §3）
miRNA–蛋白 靶预测 + 配对 Spearman 相关
联合 QC 转录组 miRNA% 与蛋白标志物/污染双通过 → 合格
不一致场景 单组学报告 + 显式「未联合验证」或「不一致」标签

与 miRNA-06 T12 对称开发。

8. 联合 QC 速查（蛋白组视角）

蛋白组信号 常见含义 与转录组对照
标志蛋白阳性、污染低 EV 蛋白特征良好 期望 miRNA% 高、签名一致
鉴定数极低 蛋白量不足或搜库失败 miRNA 可能仍正常 → 查实验
血浆蛋白极高 共分离 / 制备问题 常伴 miRNA 溶血或背景升高
胞内蛋白高 裂解污染 常伴 rRNA/mRNA 片段升高

9. 工具栈参考

步骤 常用工具
搜库（实验/HPC） MaxQuant, FragPipe, DIA-NN
鉴定 QC Perseus, 自研 R/Python
定量统计 MSstats, limma, MSqRob2
富集 clusterProfiler, g:Profiler
网络 STRING, Cytoscape
污染库 CRAP, EV-TRACK

10. 开发分期（摘要）

阶段 模块 能力
MVP P1–P6 + P10 + P12 鉴定、标志物、污染、定量、QC 报告
标准 + P7 + P8 差异蛋白与富集
完整 + P9 + P11 网络 + miRNA 多组学
可选 DDA + DIA 双引擎 +3–5 人周（见 miRNA-04 §3.2）

小结

  • 外泌体蛋白组平台核心是 鉴定 QC → EV 标志物 → 污染过滤 → 定量矩阵 → 报告，对齐 MISEV 与 EV-TRACK。
  • 搜库在 HPC/实验端完成，平台聚焦标准化 ingest 与 QC 判定，并与转录组、物理指标形成三角验证。
  • 差异与富集在 QC 放行后启用；与 miRNA 的关联分析见 miRNA-05 §5 与 miRNA-06 T12。
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