TMB概念起源于2013年Nature发表的一项研究(Signatures of mutational processes in human cancer)。在30个癌种7,000多个标本中，研究者通过全基因组测序（whole genome sequencing,WGS）和全外显子测序（whole exome sequencing, WES）技术分析了突变图谱，描述了不同癌种样本中每百万碱基（megabase, Mb）的突变数量。紧接着 2014年的一项黑色素瘤研究（Genetic Basis for Clinical Response to CTLA-4 Blockade in Melanoma）发现，免疫治疗的响应率与肿瘤突变数目有一定的相关性，通过WES检出错义突变数量大于100的患者接受免疫治疗后具有更长的总生存期（overall survival, OS），这是首个验证TMB和免疫治疗疗效相关性的研究，此后有一系列研究都不断证明TMB对免疫治疗疗效的预测作用，尤其是在非小细胞肺癌中出现大量研究成功。
2017年，Genome Medicine发表的一项10万例实体瘤患者研究(Analysis of 100,000 human cancer genomes reveals the landscape of tumor mutational burden)，探索了靶向捕获测序panel与WES检测TMB的相关性，证实了panel检测TMB的可行性与可靠性。自此肿瘤突变负荷（TMB）已被认为是多种肿瘤类型免疫治疗反应的预测生物标志物，并且逐步成为国内大Panel/WES产品的标配。但不同实验室之间的 TMB 计算、报告和解释方式存在显着差异，所以自2020年相继出现一些专家共识。
但目前尚未发布有关 TMB 验证和报告的指南。认识到当前临床 TMB 检测的挑战，分子病理学协会召集了一个由美国临床肿瘤学会、美国病理学家学会和癌症免疫治疗学会代表组成的多学科协作工作组，以审查围绕TMB 并根据调查数据、文献综述和专家共识制定 TMB 测试的分析验证和报告建议。这些建议涵盖 TMB 分析的分析前、分析和分析后因素，并且强调全面方法学描述的相关性，以实现分析之间的可比性。今天我们来看看 Recommendations for Tumor Mutational Burden Assay Validation and Reporting 指南的具体内容。
TMB 定义为已测序编码 DNA 每兆碱基 (Mb) 的非同义体细胞突变总数。据推测，高度突变的肿瘤会产生肿瘤特异性表位或新抗原，这些表位或新抗原更有可能被免疫系统识别为异体或外来物，因此被认为更适合 ICI 治疗。
然而，目前 TMB 的计算、报告和解释方式存在差异。大部分差异源于实验室特定的检测特征，包括计算区域的基因组大小、测定，是否进行仅体细胞测序或配对肿瘤种系测序，生物信息学管道的算法组件和设置，在计算中包含或排除特定变异类型，以及调整或标准化数据的其他分析方法。 13
多个分析前因素也可能影响 TMB 计算。
于是工作组通过对已发表材料进行整理和核查以及对57名参与者进行调查。虽然整体会存在很多困难（文章方法学描述不完整，涉及性能验证的资料非常有限等等）但工作组仍提出了 13 项主题专家共识建议，解决了临床 TMB 测试的实验室相关验证、报告和发布注意事项
| Recommendation no. 推荐编号 | Related area 相关领域 | Recommendation 推荐 |
|---|---|---|
| 1 | Testing 测试 | Laboratories should validate and report the enrichment method used in the TMB assay. |
| 2 | Testing 测试 | Laboratories should validate and report the size and describe the genomic regions (ie, exons, introns, and intergenic regions) used for TMB calculation. |
| 3 | Testing 测试 | Laboratories should validate TMB measurement against an orthogonal assay, and the method of TMB calculation used by the orthogonal comparison assay should be documented. |
| 4 | Testing 测试 | Laboratories should include validation samples that reflect the intended use of the TMB assay with respect to both specimen type and representative tumor types. |
| 5 | Testing 测试 | Laboratories may use reference materials to supplement but not supplant clinical samples for TMB assay validation. |
| 6 | Testing 测试 | Laboratories may use in silico validation studies to supplement but not supplant a TMB assay wet laboratory validation. |
| 7 | Testing 测试 | Laboratories should specify the sequencing mode (tumor-germline paired or somatic only) used by the TMB assay during TMB assay validation. If somatic-only sequencing is performed, filter settings used to remove common population variants should also be documented. |
| 8 | Testing 测试 | Laboratories should establish the performance parameters of bioinformatic pipelines used for TMB calculation during validation. |
| 9 | Reporting 报告 | Laboratories should report the assay name, version, and sequencing platform used for clinical TMB assays. |
| 10 | Reporting 报告 | Laboratories should report the name, version, properties, and/or settings of bioinformatic pipeline software components used for TMB calculation. |
| 11 | Reporting 报告 | Laboratories should report the specific types and/or categories of variants included in and omitted from the TMB calculation. |
| 12 | Reporting 报告 | Laboratories should report the sequencing mode (tumor-germline paired or somatic only) used by the TMB assay. If somatic-only sequencing is performed, filter settings used to remove common population variants should be provided or made available on request. |
| 13 | Publication 出版物 | Publications describing TMB assays intended for clinical applications, including description of clinical validation, should include performance characteristics that would facilitate methodological assessment. |
- 建议1：实验室应验证和报告在TMB检测中使用的富集方法
临床实验室采用的TMB评估方法缺乏统一性。尽管基于扩增子法的测序也在使用，但最流行的还是杂交捕获法。不同的靶向富集方法之间存在差异性，会影响TMB的计算。
- 建议2：实验室应验证和报告用于TMB计算的基因组区域（即外显子、内含子和基因间隔区）的大小和描述
一般来说，TMB评估的准确性与基因组测序的panel大小直接相关，小panel导致的误差较多，而WES或WGS测序导致的误差较小。现在TMB检测绝大多数的panel大小在1~2Mb（>300个基因）。
- 建议3：实验室应通过正交试验验证TMB检测结果，并应记录正交比较试验所使用的TMB计算方法
TMB检测涉及湿实验和干实验两部分，每个环节都可能会影响TMB的计算。因此，仅使用外部参考品来判断TMB检测的分析性能并不总是可行。TMB工作小组建议对所有TMB检测进行正交验证研究（如WES），以衡量其相对高质量对照的性能。
- 建议4：实验室应提供验证样本，以反映TMB检测在标本类型和代表性肿瘤类型方面的预期用途
在选择用于验证TMB检测的样本（例如组织FFPET-DNA或血液ctDNA）时，应考虑正在开发的检测类型，因为不同的检测具有不同的特性和样本要求。同时，考虑到不同肿瘤类型的TMB不同，实验室应将常见肿瘤类型纳入其TMB检测的分析性能评估中。
- 建议5：实验室可以使用参考品作为TMB检测验证的补充，但不能替代临床样本
根据实践调查结果，缺乏具有明确TMB的样本用于检测开发和验证是TMB检测实施的主要障碍。多个参考品来源（如市售质控品、细胞系、已知MSI阳性或POLE高突变样品）是可用于评估TMB准确度和精密度以及评估TMB检测分析测量范围和检测下限的。
- 建议6：实验室可以使用计算机验证研究来补充但不能取代TMB检测的湿实验验证
进行计算机正交验证（虚拟验证）实验具有诸多优势，包括减少验证时间和成本以及能够以独立方式验证检测的生物信息学部分。由于计算机验证方法是总TMB分析的一部分，因此应将其视为包括湿实验和生信性能评估的验证补充，而不是替代。
- 建议7：实验室应在TMB检测验证期间指定TMB检测使用的测序模式（肿瘤体系-胚系配对或仅肿瘤体系）；如果进行仅肿瘤体系测序，用于去除常见群体变异的过滤算法设置也应记录在案
根据实践调查结果，约有一半的实验室是进行肿瘤体系-胚系配对测序，有一半实验室是进行仅肿瘤体系测序。由于只有体系变异才有能力产生肿瘤新生抗原，因此在TMB评估分析之前去除胚系变异非常重要。如果仅进行肿瘤体系变异检测，则应适当验证用于胚系变异过滤的具体方法及其局限性。
- 建议8：实验室应在验证过程中建立用于TMB计算的生物信息学流程的性能参数
不同NGS检测和不同实验室的变异检出算法策略有所不同，因此确定特定变异调用流程非常重要。比如，实验室通常不会分析报告同义突变，但对于包含同义突变类型的TMB算法，需要对流程进行评估。
- 建议9：实验室应报告临床TMB检测所用的检测名称、版本和测序平台
随着癌症诊断中重要基因和基因组变异的开发和识别，实验室检测panel可能会更新升级。此外，即使在同一实验室，分析流程和版本不同，TMB值也不一定具有可比性
- 建议10：实验室应报告用于TMB计算的生物信息学流程软件组件的名称、版本、属性和/或设置
变异调用的算法策略因NGS检测而异，一些实验室可能会使用多个调用程序，并采用变异调用的并集进行TMB分析，应关注其生信流程名称、版本和属性等因素。
- 建议11：实验室应报告TMB计算中包含和排除的变异具体类型和/或类别
目前，已发表的文献中没有足够的证据来具体推荐哪些变异类型应纳入TMB计算。在缺乏技术标准化的情况下，为了能够对TMB检测进行比较，需要将此信息作为报告的一部分进行传达，报告应清楚地指出TMB计算中包含和排除的表一类型。鉴于在不同检测中所查询的基因组区域存在差异，TMB工作组建议将TMB报告为每Mb中的突变数值，而不是NGS检测中发现的突变总数，以便于解释TMB报告并实现检测结果之间的比较。
- 建议12：实验室应报告TMB检测所使用的测序模式（肿瘤体系-胚系配对或仅肿瘤体系）；如果进行仅肿瘤体系测序，应提供用于去除常见群体变异的过滤算法设置，或应要求提供
检测样本和测序模式应在TMB报告中明确说明。如果存在用于实施TMB计算算法的验证研究，则应引用该验证研究。
- 建议13：描述用于临床应用的TMB检测出版物（包括临床验证描述）应包括有助于方法学评估的性能特征
改进TMB出版物的报道具有巨大的潜力，可以规范化临床TMB检测开发、识别影响检测性能的变量，并促进TMB检测实施。