表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance，SPR） 与 生物膜层干涉（BioLayer Interferometry，BLI） 是抗体研发中测定 (K_{\mathrm{D}})、(k_{\mathrm{on}})、(k_{\mathrm{off}}) 的两大主流 实时、无标记（label-free） 平台。二者均记录结合–解离全过程的 sensorgram（传感曲线），以 1:1 Langmuir 或扩展模型拟合动力学常数，被业界视为 (K_{\mathrm{D}}) 表征的 金标准（相对 ELISA (EC_{50}) 等终点读数）。
本文属 指标子系列，在 抗体-02.指标-01.亲和力指标总览 与 抗体-02.指标-02.EC50与KD的测定与换算 基础上，专述 SPR/BLI 的 物理原理、实验机制、数据解读、优劣势与局限性；结合原理见 抗体-03.互作-01.抗体抗原互作原理介绍；测定条件对读数的影响见 抗体-03.互作-02.影响亲和力的因素 §6–§7。
段末注释：Sensorgram 为结合信号随时间变化的曲线，通常含 结合相（association） 与 解离相（dissociation） 两段。
读前说明
- 默认讨论 可逆、非共价、单价或可控价态 的抗体–蛋白抗原结合。
- 文中 Ligand = 固定相分子，Analyte = 溶液中注入/浸泡的分子；抗体与抗原哪端固定需在报告中明确。
- 动力学拟合默认 1:1 结合模型；双价（bivalent）模型在 §6 单独说明。
1. 共同框架：实时动力学能测什么
1.1 可逆结合与平衡常数
[
\mathrm{L} + \mathrm{A} \rightleftharpoons \mathrm{LA}
]
[
K_{\mathrm{D}} = \frac{[\mathrm{L}][\mathrm{A}]}{[\mathrm{LA}]} = \frac{k_{\mathrm{off}}}{k_{\mathrm{on}}}
]
SPR/BLI 直接观测的是界面处 复合物量随时间的变化，而非终点信号。拟合得到 (k_{\mathrm{on}})（结合速率常数，单位 M(^{-1})s(^{-1})）与 (k_{\mathrm{off}})（解离速率常数，单位 s(^{-1})），再由 (K_{\mathrm{D}} = k_{\mathrm{off}}/k_{\mathrm{on}}) 得到平衡解离常数。
1.2 典型 sensorgram 形态
1 | 响应 (RU 或 nm) |
| 阶段 | 物理过程 | 拟合参数 |
|---|---|---|
| Association | Analyte 扩散至界面、识别、复合 | (k_{\mathrm{on}}) |
| Steady state | 结合与解离达动态平衡 | (R_{\mathrm{eq}}) 可与 (K_{\mathrm{D}}) 关联 |
| Dissociation | 换 buffer，复合物解离 | (k_{\mathrm{off}}) |
全局拟合（global fit）：对多条浓度梯度的 association + dissociation 同时拟合，比单条曲线更稳健。
1.3 与 ELISA、ITC 的定位
| 平台 | 输出 | 实时动力学 | 通量 | 典型角色 |
|---|---|---|---|---|
| SPR | (k_{\mathrm{on}}, k_{\mathrm{off}}, K_{\mathrm{D}}) | 是 | 中 | Lead 表征、发表、IND |
| BLI | 同上 | 是 | 高 | 初筛确认、库排序 |
| ELISA | (EC_{50}) 等 | 否 | 很高 | 杂交瘤/噬菌体初筛 |
| ITC | (K_{\mathrm{D}}, \Delta H, n) | 否（平衡滴定） | 低 | 热力学验证、机制 |
段末注释：ITC（Isothermal Titration Calorimetry，等温滴定量热法） 直接测结合放热/吸热，可得焓变 (\Delta H) 与化学计量 n，但耗样大、通量低。
2. SPR：原理与机制
2.1 物理原理
SPR 基于 金属表面（通常为金膜） 上的 等离子体共振（plasmon resonance） 现象：
- 近表面入射 偏振光（常为近红外，~670–790 nm）。
- 在特定 入射角 下，光子能量耦合于金属–介质界面的 表面等离子体（surface plasmon），发生 共振吸收，反射光强度出现 极小值。
- 界面附近存在 倏逝场（evanescent field），穿透深度约 ~200 nm——仅对该范围内的质量变化敏感。
- 当 analyte 结合到芯片表面固定化的 ligand 上，局部 折射率（refractive index） 升高，共振条件改变，表现为 共振角位移 或 波长位移；仪器将其转化为 响应单位（Response Unit，RU），1 RU ≈ 表面 1 pg/mm² 的蛋白质量变化（经验换算，依分子而异）。
核心检测量：界面 光学厚度 / 折射率变化 (\propto) 结合到表面的生物分子质量。
1 | 入射光 |
2.2 仪器与流动体系
代表平台：Cytiva Biacore 系列、Bruker Sierra SPR 等。
| 组件 | 功能 |
|---|---|
| 传感器芯片（Sensor chip） | CM5（羧甲基葡聚糖）、NTA、SA 等化学表面 |
| 微流控通道（Flow cell） | 常 2–8 通道；并行 参比通道（reference） 扣除 bulk 与非特异 |
| 注射泵 / 自动进样器 | 精确控制 analyte 浓度、流速、接触时间 |
| 检测单元 | 监测 SPR 角/波长变化 → RU |
参比减法（reference subtraction）：一侧固定 ligand，另一侧仅基质或空白，扣除 体折射率（bulk effect） 与非特异吸附，得到 特异性结合信号。
2.3 固定化（Immobilization）化学
| 方法 | 机制 | 适用 | 注意 |
|---|---|---|---|
| Amine coupling（E DC/NHS） | 赖氨酸 ε-NH₂ 与活化羧基共价连接 | 通用蛋白 | pI 附近偶联；可能遮蔽活性位点 |
| NTA-His | Ni-NTA 螯合 His-tag | 重组抗原/抗体 | 标签取向可预测；需咪唑洗脱再生 |
| Biotin–Streptavidin（SA） | 生物素化 ligand 高亲和捕获 | 低 pI 蛋白、定向生物素化 | SA 四价；生物素化位点影响取向 |
| Thiol coupling | 半胱氨酸巯基与金/马来酰亚胺反应 | 定向偶联（C 端/特定位点） | 需游离 Cys 或引入 linker |
取向效应：固定化可能限制 ligand 构象或 favor 某一 paratope 朝向，改变表观 (k_{\mathrm{on}})——抗体工程中常比较 Ab 固定 vs Ag 固定 或采用 Fab 片段 降低多价干扰。
2.4 实验流程
- 芯片预处理：缓冲液平衡至基线稳定。
- Ligand 固定化：达到目标 固定化水平（immobilization level）（通常 100–500 RU 量级，过高易 质量传输限制 与 位阻）。
- 表面封闭：乙醇胺 等封闭残余活性基团。
- 动力学运行：多浓度 analyte（建议覆盖 0.1×–10× (K_{\mathrm{D}})）依次注入；结合相 60–300 s，解离相 300–1200 s（依 (k_{\mathrm{off}}) 调整）。
- 再生（Regeneration）：低 pH Gly-HCl、MgCl₂ 等恢复表面，下一样本结合量一致。
- 拟合：1:1 Langmuir 全局拟合；必要时 bivalent、mass transport 修正模型。
2.5 动力学方程（1:1 Langmuir）
结合相：
[
\frac{dR}{dt} = k_{\mathrm{on}} \cdot C \cdot (R_{\max} - R) - k_{\mathrm{off}} \cdot R
]
解离相（(C = 0)）：
[
\frac{dR}{dt} = -k_{\mathrm{off}} \cdot R
]
其中 (C) 为 analyte 体相浓度，(R_{\max}) 为饱和结合响应，(R) 为实时响应。
稳态结合量：
[
R_{\mathrm{eq}} = \frac{R_{\max} \cdot C}{K_{\mathrm{D}} + C}
]
与 ELISA 占据分数 (\theta = [Ab]/([Ab]+K_{\mathrm{D}})) 形式一致——理想 1:1 时 半数饱和浓度 = (K_{\mathrm{D}})。
2.6 质量传输限制（Mass Transport Limitation，MTL）
Analyte 从体相扩散至芯片表面的速率 慢于 内在结合速率时，sensorgram 上升沿变 圆钝，高浓度区拟合 (k_{\mathrm{on}}) 偏低、(K_{\mathrm{D}}) 失真。
| 识别特征 | 缓解策略 |
|---|---|
| 高浓度曲线「平顶」早现、(k_{\mathrm{on}}) 随浓度漂移 | 提高流速；降低固定化密度；降低 analyte 浓度上限 |
| 拟合需引入 MT 系数 | 报告时注明；优先优化实验而非仅改模型 |
段末注释：MTL 指 analyte 向活性表面的扩散成为限速步骤，曲线形态不再由纯化学动力学主导。
3. BLI：原理与机制
3.1 物理原理
BLI 基于 白光干涉（white-light interferometry）：
- 生物传感器探针（biosensor tip） 末端涂覆 生物相容聚合物层（如 super streptavidin、protein A 等）。
- 近红外宽带光从探针内部射向 探针–溶液界面，部分反射光与 界面生物分子层 反射光发生 干涉。
- 结合分子改变界面 光学厚度（optical thickness），干涉光谱 峰位移动（shift） 被检测，转换为 nm 或仪器单位（如 Octet 的 nm 响应）。
与 SPR 的本质差异：
| SPR | BLI | |
|---|---|---|
| 激发 | 共振角/波长耦合 | 宽带干涉条纹位移 |
| 几何 | 平面芯片 + 流动 | 圆柱探针 + 浸泡 |
| 敏感深度 | ~200 nm 倏逝场 | 界面分子层厚度 |
| 样品 | 需注入流动相 | Dip-and-read，可直接测粗样品 |
1 | 探针杆 |
3.2 仪器与探针体系
代表平台：Sartorius Octet（原 ForteBio）系列。
| 组件 | 功能 |
|---|---|
| Biosensor | SA、NTA、Protein A、Anti-hIgG Fc 等预涂层探针 |
| 探针架 | 最多 8–16 根并行浸泡不同孔 |
| 微孔板 | 96/384 孔；每孔 200 μL 量级 |
| 温控与振荡 | 减少传质梯度；维持 25/30/37 °C |
Dip-and-read 工作流：探针浸入 缓冲液 → 基线 → 浸入 analyte 孔（结合）→ 回到 缓冲液（解离）→ 再生孔（可选）→ 下一浓度循环。
3.3 固定化策略
与 SPR 概念类似，但 探针化学 不同：
| 探针类型 | 捕获方式 |
|---|---|
| SA（Streptavidin） | 生物素化 ligand |
| NTA | His-tag 蛋白 |
| Protein A / G | Fc 捕获 IgG |
| Amine-reactive（AR2G 等） | 共价偶联 |
Protein A 捕获 IgG：快速但 Fc 取向固定、且 IgG 为 二价 analyte——测全抗时常需 bivalent 模型 或改用 Fab/抗原固定 策略。
3.4 实验流程与参数
- 探针浸润：缓冲液中平衡至基线漂移 < 0.05 nm/min。
- Ligand 加载：将探针浸入含 ligand 的孔，至目标加载量（通常 0.5–2.0 nm shift）。
- 结合：浸入 analyte 梯度孔 60–300 s。
- 解离：缓冲液中 60–600 s。
- 再生：如 10 mM Gly-HCl pH 1.7，或 SDS（依化学耐受性）。
- 拟合：Octet 软件或全局分析工具，1:1 或 bivalent 模型。
浓度系列：至少 4–5 个有效浓度点；高亲和力（(k_{\mathrm{off}}) 极小）需 延长解离时间 以可靠拟合 (k_{\mathrm{off}})。
3.5 BLI 特有现象
| 现象 | 机制 | 应对 |
|---|---|---|
| 蒸发 / 弯液面 | 长时间孔板开放，液面下降改变光路 | 加盖、矿物油覆盖、控湿 |
| 孔间交叉污染 | 探针携带液滴 | 洗涤孔充分浸泡、降低携带体积 |
| 非特异吸附 | 粗样品中杂蛋白粘附探针 | 加 BSA/Tween；参比探针；稀释样品 |
| 搅拌/传质 | 孔内扩散慢于 SPR 流动 | 提高振荡；延长结合时间 |
4. SPR 与 BLI 对比
4.1 核心指标对比
| 维度 | SPR | BLI |
|---|---|---|
| 灵敏度 | 极高（低 pM–nM (K_{\mathrm{D}}) 可测） | 良好（通常 nM–μM 更稳；极强结合需长解离） |
| 动力学分辨率 | 可分辨 (k_{\mathrm{off}} \sim 10^{-6}) s(^{-1}) 量级 | 略低；快速事件与长解离需优化设计 |
| 样品基质耐受 | 要求较洁净；浊液/颗粒干扰大 | 耐受细胞上清、血清、DMSO 等更宽容 |
| 耗样量 | 通常需数十–数百 μL 流动 | 孔板 200 μL/孔；可更低体积 |
| 通量 | 1–8 通道串行，日测数十样品 | 8–16 探针并行，日测数百 更可行 |
| 自动化 | 高（Biacore 8K+ 等） | 高（384 孔板兼容） |
| 设备与耗材成本 | 仪器与芯片成本高 | 探针可重复使用次数有限，但初筛性价比高 |
| 固定化灵活性 | 化学偶联种类丰富 | 预涂层探针为主，自定义偶联选项较少 |
| 文献认可度 | 最高（监管与发表首选） | 高（筛选与并行表征）；部分审稿人要求 SPR 复核 |
4.2 优势汇总
SPR 优势：
- 动力学数据 精度与分辨率 业界标杆，适合 (k_{\mathrm{off}}) 极小 的高亲和力抗体。
- 流动相 传质可控，MTL 可系统表征与校正。
- 参比通道 与成熟软件生态（Biacore Insight Evaluation 等）。
- 监管申报（IND/BLA）中 SPR (K_{\mathrm{D}}) 接受度最高。
BLI 优势：
- 通量高、上手快：杂交瘤/噬菌体库 hit confirmation 理想。
- 粗样品友好：可直接测表达上清，减少纯化步骤。
- 无微流控堵塞 风险；维护相对简单。
- 耗材按 探针次 计费，初筛 成本结构 更灵活。
4.3 共同局限
| 局限 | 说明 |
|---|---|
| 固定化取向 | Ligand 活性位点是否暴露；Amine coupling 随机取向 |
| 价态 / Avidity | IgG 二价 analyte 使 1:1 模型失效 → (K_{\mathrm{D,app}}) |
| 再生不完全 | 表面活性下降、历史结合记忆 |
| 非特异结合 | 杂蛋白、缓冲组分吸附于表面/探针 |
| 缓冲液匹配 | 体相与运行缓冲折射率/粘度差异 → 漂移 |
| 强结合 (k_{\mathrm{off}}) | 解离过慢，需外推或改用 稳态法 估 (K_{\mathrm{D}}) |
| 弱结合 | (K_{\mathrm{D}} > \mu)M 时信号弱、噪声占比大 |
5. 实验设计要点（抗体场景）
5.1 谁固定、谁流动？
| 策略 | 适用 | 风险 |
|---|---|---|
| Ag 固定，Ab 为 analyte | 常规亲和力排序 | 高浓度 Ab 聚集 |
| Ab 固定，Ag 为 analyte | 多克隆比较同一抗原 | 抗体取向不均 |
| Fab + 单体 Ag | 单价 (K_{\mathrm{D}}) 金标准 | 表达与制备成本 |
| IgG 固定（Protein A） | 快速测 Ag 结合 | Bivalent 模型必须 |
5.2 单价 (K_{\mathrm{D}}) 的推荐条件
与 抗体-02.指标-02 §2.4 一致：
- Fab / Fv 或 单体抗原 + 明确价态模型。
- 抗原 可溶性、构象均一（非膜蛋白聚集体）。
- 固定化水平 适中（SPR 100–500 RU；BLI 0.5–1.5 nm）。
- 温度、pH、离子强度 标注并与体内相关条件对照。
- 至少 一次反向固定化（swap orientation）验证趋势一致。
5.3 亲和力分级（经验）
| (K_{\mathrm{D}}) 范围 | 结合强度 | SPR/BLI 注意 |
|---|---|---|
| < 1 nM | 很高 | 解离相需 ≥ 600–1800 s；BLI 长解离占孔时间 |
| 1–100 nM | 高（治疗抗体常见） | 标准动力学设计 |
| 100 nM – 1 μM | 中等 | 可提高 analyte 浓度 |
| > 1 μM | 弱 | 信号弱；考虑 ITC 或稳态法 |
6. 数据拟合与质量控制
6.1 模型选择
| 模型 | 适用场景 |
|---|---|
| 1:1 Langmuir | Fab–单体 Ag |
| Bivalent analyte | IgG 为 analyte、单价 Ag 固定 |
| Heterogeneous ligand | 固定化不均一、多表位 |
| Mass transport | 高 RU、高 (k_{\mathrm{on}}) 时 MTL 明显 |
6.2 质量检查清单
- 基线漂移 < 5 RU/min（SPR）或 < 0.05 nm/min（BLI）
- 参比/空白扣除后，低浓度曲线信噪比足够
- 解离相拟合残差随机，无系统性弯曲（否则换模型或查再生）
- (k_{\mathrm{off}}) 与解离相时长匹配：(t_{\mathrm{diss}} \gtrsim 5/k_{\mathrm{off}})
- 再生后下一循环结合量恢复 ≥ 90%
- 浓度系列覆盖 (K_{\mathrm{D}}) 两侧
6.3 常见拟合失败原因
| 现象 | 可能原因 |
|---|---|
| (k_{\mathrm{on}}) 随浓度系统性变化 | MTL；固定化过高 |
| 解离相几乎平坦但 ELISA 很强 | (k_{\mathrm{off}}) 太小，解离时间不够 |
| 结合不饱和 | 浓度范围不足；活性 analyte 比例低 |
| 高浓度响应下降 | 聚集、沉淀、非特异竞争 |
| 重复运行漂移 | 再生损伤；探针老化（BLI） |
7. 抗体研发中的典型工作流
1 | [库筛选] ELISA / FACS → EC50 排序（高通量） |
Binning（表位分组）：固定抗原，先饱和结合 Ab1，再注入 Ab2；若 Ab2 仍结合则为 不同表位——与亲和力测定共用平台，但读数为 竞争格局 而非 (K_{\mathrm{D}})。
8. 报告规范（SPR/BLI 专用补充）
在 抗体-02.指标-02 §8.1 基础上，建议补充：
| 字段 | SPR 示例 | BLI 示例 |
|---|---|---|
| 仪器 | Biacore 8K | Octet R8 |
| 芯片/探针 | CM5, SA | SA, Protein A |
| 固定化 | Ag amine coupling, 280 RU | Biotinylated Ag, 1.2 nm |
| 流向 | Ab 为 analyte, 30 μL/min | 结合 120 s, 解离 600 s |
| 模型 | 1:1 global | 1:1 global |
| 结果 | (k_{\mathrm{on}}=2.1\times10^{5}) M(^{-1})s(^{-1}), (k_{\mathrm{off}}=3.2\times10^{-4}) s(^{-1}), (K_{\mathrm{D}}=1.5) nM | 同左 |
禁止：仅报告「亲和力 < 1 nM」而无 (k_{\mathrm{on}}/k_{\mathrm{off}})；将 IgG bivalent 拟合结果标为 单价 (K_{\mathrm{D}}) 而不注明模型。
9. 小结
| 主题 | SPR | BLI |
|---|---|---|
| 原理 | 金膜表面等离子体共振 → 折射率变化 → RU | 探针端干涉光谱位移 → nm |
| 机制 | 微流控注入、平面芯片、参比减法 | 孔板浸泡、dip-and-read |
| 强项 | 动力学精度、监管认可、极强结合 | 通量、粗样品、操作简便 |
| 弱项 | 成本高、样品洁净度、MTL | 极强/极弱结合边界、探针耗材 |
| 抗体实践 | Lead 与注册 (K_{\mathrm{D}}) 首选 | 库确认与并行排序首选 |
二者互补：BLI 筛、SPR 定 是工业界常见组合。无论平台，报告 (K_{\mathrm{D}}) 时必须交代 固定化化学、分子格式、拟合模型与溶液条件，并与 ELISA (EC_{50}) 区分使用——计算训练与文献对比方可 reproducible。