小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）的 RNA 干扰（RNA interference，RNAi）活性与先天免疫（innate immunity）激活在分子上可以并存、分离或相互拮抗：同一条 siRNA 既可能高效装载 RISC（RNA-induced silencing complex）切割靶 信使 RNA（messenger RNA，mRNA），又可能在内体或胞质被模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）感知，诱导 I 型干扰素（type I interferon）与促炎细胞因子。后者会改变细胞转录组、翻译状态与存活率，使 qPCR/Western 读出难以区分「靶向沉默」与「免疫脱靶」，甚至出现敲低假象或敲低失败。
段末注释：PRR 为识别病原体相关分子模式的受体家族；I 型干扰素 主要包括 IFN-α、IFN-β，可广泛诱导干扰素刺激基因（interferon-stimulated gene，ISG）表达。
本篇聚焦序列依赖性免疫刺激（常称 immunostimulatory RNA，isRNA，与功能性 siRNA 相对）；载体、浓度与 2’ 化学修饰的免疫学效应见 siRNA-02-分子形式化学修饰与递送概览.md。结构分区见 siRNA-06-序列结构区域与生命周期.md。
读前说明：免疫活性高度依赖细胞类型（树突状细胞 vs 普通贴壁细胞）、转染试剂、siRNA 浓度与是否 2’-O-甲基（2’-O-methyl，2’-O-Me）修饰；下文基序与阈值来自文献体外体系，宜作设计排除规则而非绝对定律。
1. 为何免疫反应会「干扰」敲低？
1.1 与 RNAi 平行的几条通路
| 传感器 | 主要配体特征 | 典型细胞区室 | 主要下游 |
|---|---|---|---|
| TLR7 | ssRNA、G/U 富集基序 | 内体（pH 酸性） | IFN-α（浆细胞样树突状细胞，pDC）、IFN-β |
| TLR8 | ssRNA、A/U 富集 | 内体 | IFN-α、TNF-α（单核细胞） |
| TLR3 | 长 dsRNA（通常 >~40 bp） | 内体 | IFN-β、IL-6 等 |
| PKR | dsRNA（长度依赖） | 胞质 | eIF2α 磷酸化 → 翻译全面抑制 |
| RIG-I / MDA5 | 5’ 三磷酸 ssRNA、长 dsRNA 等 | 胞质 | IFN-β、ISG |
标准 ~21 nt 双链在未修饰且经脂质转染进入内体时，TLR7/8 相关序列效应报道最多：双链在内体中部分解链后，U 富集单链上的短基序暴露，触发 MyD88—IRF7/NF-κB 轴（见 图 1）。
1.2 对敲低读出的具体干扰方式
- 全局转录变化：ISG 上调；部分与靶基因无关的 mRNA 下降，qPCR 出现「非 RISC」的下降。
- 翻译关闭：PKR 或 IFN 通路抑制翻译，Western 条带普遍变弱，掩盖靶蛋白特异性变化。
- 细胞毒性：高浓度免疫刺激性 siRNA 导致死亡或生长停滞，有效 siRNA 浓度下降。
- 表型混淆：在抗病毒、炎症、凋亡通路研究中，表型可能来自免疫激活而非单基因敲低。
- 与脱靶叠加：免疫刺激性 siRNA 的转录组变化可与 seed（种子区）脱靶谱叠加，RNA-seq 解释难度上升（见
siRNA-05-设计指标脱靶与验证.md）。
段末注释：eIF2α 为翻译起始关键因子；其磷酸化可抑制整体蛋白合成。
2. 序列依赖性免疫刺激：主流机制模型
2.1 单链暴露模型（TLR7/8）
关键实验观察（人外周血单个核细胞，peripheral blood mononuclear cell，PBMC 体系）：
- 同一 siRNA 的单链往往比退火双链更能刺激 TLR7/8。
- 双链 Tm（解链温度）越高、杂交越强，部分研究中免疫刺激反而减弱——提示内体中需有一定解链才能暴露刺激基序。
- U 含量更高的那条链更常被视为「免疫学意义上的敏感链」；在 U 富集背景中引入单个 G 可显著增强刺激（poly-U 上「点突变式」的 G）。
因此设计时不仅看「整条 G+U 百分比」（双链上 G+U 总数由长度固定），更要扫描单链上的局部基序与 U 连续段。
2.2 与递送、浓度的耦合
- 阳离子脂质 / lipoplex：促进内体摄取，TLR7/8 通路更易被观察到；裸转或电穿孔路径不同。
- 浓度：免疫刺激常呈剂量依赖；敲低亦依赖浓度——同一实验需设置阴性对照 siRNA（non-targeting control，NTC）与仅载体对照，且浓度矩阵一致。
- 化学修饰：2’-O-Me、2’-F 等可降低 TLR7/8 识别（见 §5）；硫代磷酸（phosphorothioate，PS）主要改善稳定性，不自动消除序列免疫原性。
3. 常见免疫刺激性基序与文献锚点
下列基序多指单链 RNA 上下文（常为 siRNA 某一组分在内体解链后）；位置多相对于该敏感链的 5’→3’。
3.1 基序速查表
| 基序 / 模式 | 示例（5’→3’） | 关联受体 / 效应 | 备注 |
|---|---|---|---|
| UGU 三联体 | …UGU… |
TLR7 | 最短报道之一；嵌入可提升刺激 |
| UGUGU 五联体 | …UGUGU… |
TLR7 | 经典强效基序；常用于 isRNA 设计 |
| GUCCUUCAA 九联体 | 完整 9 nt | TLR7、IFN-α | 见于强效 siRNA 正义链 3’ 端报道 |
| U 连续段 | UUUU（≥4） |
TLR7/8 | poly-U 背景敏感；偶发 G 增强 |
| GU 富集 / GU 二核苷酸重复 | GUGUGU…、GUGU 重复 |
TLR7 | 与 HIV TAR 等区域研究交叉 |
| AU 富集段 | AUAU…、高 A+U |
TLR8（单核细胞） | pDC 与单核细胞应答谱可不同 |
| UGGC 等四联体 | 文献列举扩展基序 | TLR7/8 | 综述中常与 UGUGU 并列 |
| 长 dsRNA 区段 | >30–40 bp 双链 | TLR3、PKR | 非典型 21 mer，但 shRNA、体外转录 需注意 |
并非「含 U 即禁用」：正常有效 siRNA 往往仍含多个 U；风险来自特定排列、单链暴露与实验系统敏感性的组合。
3.2 代表性参考文献
| 主题 | 文献 | 要点 |
|---|---|---|
| 序列依赖性 siRNA 免疫刺激 | Judge A.D. et al., Nat Biotechnol 2005;23:457–462. doi:10.1038/nbt1081 | 脂质配方 siRNA 可诱导 IFN；鉴定 UGU、UGUGU；可设计低免疫原性序列 |
| siRNA 激活免疫系统（双链感知） | Marques J.T. et al., Nat Biotechnol 2005;23:1399–1405. doi:10.1038/nbt1161 | siRNA 长度与结构对免疫的影响；与 Judge 同期互补 |
| TLR7 识别 ssRNA | Hornung V. et al., Nat Immunol 2005;6:933–940. | GU 富集 ssRNA 激活 TLR7 |
| TLR7/8 与 siRNA 序列决定簇 | Goodchild A. et al., BMC Immunol 2009;10:40. doi:10.1186/1471-2172-10-40 | 207 条 siRNA 筛选；UGUGU、GUCCUUCAA；U 计数与 Tm 相关性 |
| RNAi 与先天免疫综述 | Sioud M., Mol Ther 2005;11:605–616. | siRNA/isRNA「双刃剑」框架 |
| 免疫刺激性 RNA 综述 | Li L. et al., Front Immunol 2017;8:553.（PMC 综述） | 汇总 UGUGU、GUCCUUCAA 等 isRNA 基序与 TLR 通路 |
| 2’-O-Me 降低免疫原性 | Robbins M. et al., Mol Ther 2007;15:716–723. | 修饰 U 位点可减弱 TLR 识别、保留 RNAi |
| 修饰核苷酸与先天免疫 | Karikó K. et al., Immunity 2005;23:165–175. | 假尿苷 等修饰 RNA 降低 TLR 刺激（mRNA 疫苗前驱工作） |
| TLR7 依赖的 siRNA 刺激 | Heil F. et al., Eur J Immunol 2004;34:1826–1833. | U 富集 ssRNA 与 TLR7 |
设计软件 / 算法（用于 in silico 过滤，需以工具文档为准）：
- DESiRNA、siDirect 等部分版本含免疫原性启发式评分；
- 商业合成平台常内置 GU/UGUGU 黑名单或 2’-O-Me 自动位点建议。
4. 实验上如何与「真敲低」区分
4.1 对照设置（最低配置）
| 对照 | 目的 |
|---|---|
| 仅转染试剂（mock） | 扣除载体本身炎症 |
| NTC siRNA（无关序列，同修饰） | 扣除转染与 siRNA 骨架效应 |
| 目标 siRNA | 待评序列 |
| （推荐）已验证低免疫 siRNA | 阳性沉默、低 ISG 的参照 |
转染条件（剂量、RNA/脂质 比、细胞密度）须在各组间完全一致。
4.2 常见评估方案
A. 分泌型读出（蛋白水平）
| 方法 | 靶标 | 优点 | 注意 |
|---|---|---|---|
| ELISA | IFN-β、IFN-α、TNF-α、IL-6 | 直观、定量 | 血清或上清需防细胞裂解污染 |
| Luminex / CBA 多因子 | 上述 + IP-10 等 | 一次测多种因子 | 成本较高 |
| 生物测定 | 上清处理 Reporter 细胞 | 敏感整合 IFN 活性 | 间接、需标化 |
B. 转录水平（ISG 面板）
常用 qPCR 基因（人/鼠需物种匹配）：
- ISG15、IFIT1、IFIT3、MX1、OAS1、RSAD2（Viperin）、IRF7
时间点：转染后 6–24 h 常可见 ISG 上升；敲低读出若在 48–72 h，应同时检测早期免疫是否已发生。
C. 通路验证与机制对照
| 干预 | 预期若主要为 TLR7/8 |
|---|---|
| 氯喹 / 羟氯喹（内体酸化抑制） | 免疫读出下降（可能影响转染效率） |
| TLR7 敲低 / 敲除细胞或 PBMC 分型 | pDC 来源 IFN-α 减弱 |
| 单链 vs 退火双链平行 | 单链刺激 ≥ 双链 |
D. 组学层面
- RNA-seq：检查 ISG 模块是否在全转录组层面协同上调；与 off-target 基因列表交叉。
- 干扰素基因特征评分（interferon signature score）：用于肿瘤免疫文献的 GSEA 基因集可借鉴。
E. 细胞活力与形态
- ATP 活力、LDH 释放、Annexin V/PI 流式；
- 免疫毒性导致的「敲低失败」常伴活力下降，而高效、低免疫 siRNA 可在较高浓度下仍维持活力。
4.3 结果解读简表
| 观测模式 | 更可能解释 |
|---|---|
| 仅目标 siRNA 致 IFN-β/ISG 升高，NTC 正常 | 序列依赖性 isRNA |
| 所有 siRNA 组均升高，mock 正常 | 转染过程或试剂批次问题 |
| mock 亦升高 | 血清、支原体、容器 RNA 污染或细胞系固有激活 |
| 靶 mRNA 下降且 ISG 暴升 | RNAi 与免疫并存；需 rescue 或换低免疫序列 |
| 靶 mRNA 不降但 ISG 高 | 免疫为主或 RISC 装载失败；检查序列与修饰 |
4.4 降低免疫原性的策略（与评估闭环）
- 重新选序列：避开 UGUGU、GUCCUUCAA 及长 UUUU；参考 Goodchild 2009 的 U 计数启发式。
- 2’-O-Me 修饰敏感 U 位点（尤其 passenger 链或 TLR 暴露面，依平台协议）。
- 降低剂量 在仍满足敲低的前提下做滴定。
- 换递送系统（可电离 LNP vs 传统阳离子脂质）——免疫谱不同。
- 药物开发中采用已批准的化学模式（GalNAc（N-乙酰半乳糖胺）偶联肝递送等）的平台经验，而非仅换序列。
5. 与系列其他文档的衔接
| 场景 | 建议阅读 |
|---|---|
| 设计阶段过滤免疫基序 | 本文 §3 + siRNA-05 §6 |
| 转染后仍无敲低 | 本文 §4 + siRNA-00-前置知识-01（内体逃逸） |
| RNA-seq 异常下调基因过多 | 本文 §4.2D + siRNA-05 §8–10 |
| 药物级安全 | siRNA-05 §12（非医疗建议） |
小结
- siRNA 可通过 TLR7/8（内体 ssRNA 基序）、TLR3/PKR（长 dsRNA）等通路激活先天免疫，与 RISC 介导的敲低相互独立又相互干扰。
- 常见高危基序包括 UGU、UGUGU、GUCCUUCAA、长 U 串及 GU 重复；权威序列筛选见 Judge 2005、Goodchild 2009。
- 评估应至少包含 NTC/mock 对照 + IFN-β 或 ISG 面板；机制验证可用内体酸化抑制或 TLR7 遗传学工具。
- 降低免疫原性需序列 + 修饰 + 递送 + 剂量联合优化，并以实验读出闭环，不能仅凭算法分数下单。
参考文献（精选）
- Judge A.D., Sood V., Shaw J.R., Fang D., McClintock K., MacLachlan I. Sequence-dependent stimulation of the mammalian innate immune response by synthetic siRNA. Nat Biotechnol. 2005;23(4):457–462.
- Marques J.T., Williams B.R.G. Activation of the mammalian immune system by siRNAs. Nat Biotechnol. 2005;23(11):1399–1405.
- Goodchild A., Nopper N., Tetzlaff M.T., et al. Sequence determinants of innate immune activation by short interfering RNAs. BMC Immunol. 2009;10:40.
- Hornung V., Guenthner-Biller M., Bourquin C., et al. Sequence-specific potent induction of IFN-α by short interfering RNA in plasmacytoid dendritic cells through TLR7. Nat Immunol. 2005;6(9):933–940.
- Sioud M. Induction of inflammatory cytokines and interferon responses by siRNA and isRNA: cellular mechanisms and potential clinical applications. J Mol Biol. 2009;386(5):1130–1138.（综述性讨论 siRNA vs isRNA）
- Robbins M., Judge A., Liang L., et al. 2’-O-methyl-modified RNAs act as TLR7 antagonists. Mol Ther. 2007;15(9):1663–1669.
- Karikó K., Buckstein M., Ni H., Weissman D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 2005;23(2):165–175.